P57
Fiber-based scaffolds with local pore-size grading and customized geometry
*R. Brünler1, C. Heinemann2, D. Aibibu1, T. Hanke2, C. Cherif1
1Institut für Textilmaschinen und Textile Hochleistungswerkstofftechnik der TU Dresden, Bio- und Medizintextilien, Dresden, Deutschland
2Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien, Dresden, Deutschland
Introduction:
The additive Net Shape Nonwoven (NSN) technology enables the design of scaffolds of short fibers. The nonwoven structures are used as a cell support structure for bone regeneration. Structures with porosities from 90% to 99% can be manufactured. A newly developed fiber processing unit allows adjusting the porosity locally. Thus, scaffolds with local pore-size grading for mimicking multiple types of bone tissue can be realized.
Materials and Methods:
The osteoconductive acting polysaccharide chitosan can be processed into fibers with specifically adjustable diameter and tensile strength in a wet spinning process developed at ITM. The fibers show no impurities or residues from the spinning process.
The fibers can be processed into three dimensional scaffolds in the additive NSN-process. The local porosity of the NSN-structures can be adjusted precisely by setting the production parameters fiber length, fiber diameter and adhesive screening. To achieve an improved cell response, the scaffolds can be functionalized with a collagen coating and mineralization.
Results and Discussion:
The fibrous structure creates large, interconnecting and graded pore spaces that allow the growth and migration of seeded cells. The functionalization of the scaffolds leads to a considerable enlargement of the surface area and improves the cell adhesion of the seeded hMSC.
Acknowledgement:
Wir bedanken uns bei der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die finanzielle Förderung des Forschungsprojektes DFG CH 174-24/2.
P58
Herstellung und in vitro-Untersuchung 3D-gedruckter Polycaprolacton-CaCO3-Scaffolds für den Knochenersatz
*J. Neunzehn1, R. Neumann1, T. Flath2, H.- P. Wiesmann1
1Technische Universität Dresden, Professur für Biomaterialien, Dresden, Deutschland
2HTWK Leipzig , Fakultät Maschinenbau und Energietechnik, Leipzig, Deutschland
Einleitung:
Knochenersatzmaterialien werden immer häufiger auf Polymerbasis entwickelt und mit wirkstofffreigebenden Additiven versehen. Dies hängt auch mit den sich stetig weiterentwickelnden Fertigungsverfahren wie dem Fused Deposition Modelling (FDM) zusammen. Niedrigschmelzende und biodegradable Polymere wie Polycaprolacton (PCL) besitzen für diesen Herstellungsprozess optimale Eigenschaften bezüglich ihrer Verarbeitbarkeit und Mischbarkeit mit unterschiedlichen Mineralphasen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mittels FDM offenporige 3-D-gedruckte PCL-Scaffolds mit unterschiedlichen Calciumcarbonatanteilen (CaCO3) hergestellt und auf Ihre Eignung als Knochenersatzmaterial untersucht.
Materialien und Methoden:
Über die Herstellung unterschiedlich konzentrierter CaCO3-PCL-Pasten (CaCO3-Anteile: 10, 20, 33 und 50 %) wurden Prüfkörper unterschiedlicher Geometrien hergestellt.
Die Mineralverteilung innerhalb der Scaffold, deren Struktur und Morphologie wurden rasterelektronenmikroskopisch charakterisiert. Die Zellverträglichkeit der Materialien wurde in vitro an SAOS-2-Zellen mittels LDH-, ALP- sowie DNA-Nachweis untersucht. Das Degradationsverhalten, die Calciumfreigabe sowie die Bioaktivität der Materialkombinationen wurden nach Inkubation in unterschiedlichen Medien (PBS, NaCl und einer Lipase-Lösung) mit unterschiedlichen Verfahren evaluiert. Zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften wurden die Materialien sowohl als poröse Scaffolds als auch als Bulkmaterial einem Druckversuch unterzogen.
Ergebnisse und Diskussion:
Bei allen untersuchten Mischungsverhältnissen konnten homogene Partikelverteilungen über den Gesamtquerschnitt der gedruckten Scaffolds nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass über die CaCO3-Konzentration in den PCL-CaCO3-Proben sowohl die Proliferation als auch die osteogene Differenzierung der verwendeten Zellen gezielt gesteuert werden kann. Ebenfalls sind die Degradationsgeschwindigkeit, der Calciumrelease und die Bioaktivität durch den CaCO3-Gehalt in den 3D-gedruckten Scaffolds einstellbar und dadurch kontrollierbar. Die Degradation in einer Enzymlösung deuten darauf hin, dass der CaCO3-Gehalt somit ebenfalls in vivo einen Einfluss auf die Abbaugeschwindigkeit als auch die Biomineralbildung der Scaffolds im Knochendefekt haben könnte.
P59
Artificial extracellular matrix to enhance new bone formation in a critical size bone defect in the rat femur
*Y. Förster1, V. Hintze2, A. Wenke1, S. Manthey1, H. Zimmermann2, D. Scharnweber2, S. Rammelt1,3
1UniversitätsCentrum für Orthopädie und Unfallchirurgie, Dresden, Deutschland
2Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien, Institut für Werkstoffwissenschaft, Dresden, Deutschland
3Zentrum für Regenerative Therapien Dresden, Dresden, Deutschland
Introduction:
The therapy of critical size bone defects still represents a significant clinical problem. The standard treatment for the repair is autologous bone grafting which is associated with numerous adverse side effects. Therefore, research has focused on the development of biodegradable polymer scaffolds with specific coatings to improve the osteoconductive and osteoinductive properties of these scaffolds. One promising approach is applying components of the organic extracellular matrix (ECM) that mimic a favourable environment for bone forming cells like osteoblasts and their progenitors. So, highly sulfated glycosaminoglycans facilitated the osteogenic differentiation of these cells in vitro.1,2The aim of the present study was to investigate artificial ECM-coatings on polymer scaffolds in a critical size bone defect in the femur of rats.
Materials and Methods:
A 5 mm defect was created in the femur of male adult Wistar rats and stabilized with an internal fixator. Embroidered PCL (polycaprolactoneco-lactide) scaffolds were coated with collagen type I (Coll), Coll/chondroitin sulfate (Coll/CS), Coll/hyaluronan (Coll/HA). Uncoated PCL scaffolds served as negative controls, and collagen sponges with bone chips to mimic autologous bone graft served as positive controls. The rats were sacrificed after 2 and 12 weeks. New bone formation and the quality of the newly formed bone were evaluated by radiographs, micro computed tomography (μCT), and histological staining.
Results and Discussion:
PCL scaffolds were evenly coated for all surface states, however the collagen content was significantly lower in the presence of CS and HA. Radiographs and μCT measurements showed nearly no new bone formation after 2 weeks of implantation. However, after 12 weeks the new bone volume within the defect was 80%±20% for the positive control, 53%±20% for the uncoated PCL, 47%±30% for Coll, 49%±29% for Coll/CS, and 36%±19% for Coll/HA. Histological staining showed no signs of inflammation indicating a good biocompatibility of the coatings.
Coating of scaffolds with unsulfated glycosaminoglycans did not enhance new bone formation. The effect of highly sulfated glycosaminoglycans on new bone formation is currently under investigation.
References:
1Hempel U et al. (2014) Biomed Res Int. 2014:938368.
2Hess R et al. (2012) Biomaterials. 33:8975-85.
P60
Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured on Collagen-based Scaffolds enriched with IGF-1-coupled Nanoparticles
*B. Hiemer1, J. Pasold1, M. Krogull 1, C. Grüttner2, R. Bader1
1Universitätsmedizin Rostock, Orthopädische Klinik und Poliklinik, Forschungslabor für Biomechanik und Implantattechnologie, Rostock, Deutschland
2Micromod Particletechnology GmbH, Rostock, Deutschland
Introduction:
Matrix-associated autologous chondrocyte transplantation is considered to be an effective approach to treat cartilage lesions. Current research is focused on providing physiological conditions for optimal cartilaginous cell proliferation and matrix synthesis by novel biomaterials. A previous study showed that the cultivation of human chondrocytes on a collagen-based scaffold with IGF-coupled nanoparticles enhances the production of matrix proteins. To avoid harvesting side morbidity and dedifferentiation related to the use of autologous chondrocytes, in this study human mesenchymal stem cells (MSCs) were cultivated on a porcine collagen matrix enriched with IGF-coupled nanoparticles.
Materials and Methods:
Human MSCs were isolated from bone marrow by Ficoll-Paque density gradient centrifugation and cultured up to passage 3. MSCs were seeded on a collagen scaffold (1x105 cells/cm²) and red-fluorescent IGF-1-coupled nanoparticles (micromod, Rostock, Germany) or soluble IGF-1 were added once at the beginning of cultivation. Cell viability and integration within the scaffold were investigated after 3, 7, 14 and 21 days using WST-1 test and live/dead staining. Furthermore, differentiation was examined by analyzing synthesis rate of glycosaminoglycan, collagen type I and II.
Results and Discussion:
With confocal laser scanning microscope viable human MSCs are detected within the scaffold. There are no differences in metabolic activity and vitality of MSCs between the treatment groups excluding cytotoxic effect of nanoparticles. The protein expression of collagen type I is initially decreased for MSCs incubated with IGF-1 nanoparticles compared to cells cultivated with soluble IGF-1. MSCs cultured over 7 days with IGF-1 nanoparticles tent to synthesise more collagen type II. MSCs cultured over 21 days demonstrate a significant increase (p=0,015) in glycosaminoglycan content compared to MSCs supplemented with soluble IGF-1 showing only a slight increase.
Our test data indicate that the cultivation of human MSCs on collagen-based scaffold supplemented with IGF-coupled nanoparticles have a positive influence on chondrogenic differentiation of MSCs. In future studies, nanoparticles coupled with other growth factors like TGF-ß shall be analysed to optimize the promising targeted cartilage regeneration for later clinical application.
P61
Komplexe Kollagenscaffolds für das Züchten dreidimensionaler Gewebestrukturen in vitro
*M. Wiele1, I. Prade1, M. Meyer1
1Forschungsinstitut für Leder und Kunststoffbahnen (FILK) gGmbH, Leder / Biopolymere, Freiberg, Deutschland
Einleitung:
Voraussetzung für die Verwendung von Zellkulturmodellen in der versuchstierfreien Substanztestung ist der Erhalt der organtypischen Zellfunktion außerhalb des Organismus. Dafür sollte die natürliche Umgebung der Zellen möglichst genau imitiert und die Anordnung der Zellen im Gewebeverband simuliert werden können. Ein Lösungsansatz ist die 3D Kultivierung von Zellen in Bioreaktoren. Derzeit verfügbare Zellmatrizes sind allerdings in Dimension, Funktionalität und Komplexität begrenzt. Ziel der Studie war daher die Entwicklung von Matrices, die in Abhängigkeit vom Zielgewebe mit spezifischen Strukturen ausgestattet und mit geeigneten Zelltypen besiedelt werden können.
Materialien und Methoden:
Als Ausgangsmaterial für die Herstellung der 3D Scaffolds wurde nicht-lösliches Kollagen eingesetzt, das aus porcinen Häuten isoliert und mittels Gefriertrocknung zu Schäumen verarbeitet wurde. Geeignete Porengrößen wurden dabei durch Variation des Trockensubstanzgehaltes (TS = 1-7 %), der Säure und des pH-Wertes (pH = 3-7) der Kollagenmasse, sowie durch die Einfriertemperatur (-196 bis -5°C) eingestellt und rasterelektronenmikroskopisch charakterisiert. Um das Überleben der Zellen im Gerüst zu sichern, wurden Versorgungskanäle aus Kollagen integriert. Dazu wurden Kollagen-Hohlfasern hergestellt, lyophilisiert oder luftgetrocknet und in die Kollagenmasse eingebettet. Die Scaffolds wurden für eine Langzeitkultivierung vernetzt und mit unterschiedlichen Zelltypen besiedelt.
Ergebnisse und Diskussion:
In Abhängigkeit von den Herstellungsparametern zeigten die Scaffolds gute Stabilität im Kulturmedium und ein homogenes Porensystemen mit durchschnittlichen Porengrößen zwischen 100 - 300 μm. Niedrige Einfriertemperaturen und ein geringer Kollagengehalt resultierten in einer faserartigen Matrix, die nur ungleichmäßig besiedelt werden konnte. Einfriertemperaturen zwischen -30 und -80°C ergab interkonnektierende Poren und ein gutes Einwachsen der Zellen. Im Rasterelektronenmikroskop zeigte sich, dass die Versorgungskanäle vollständig von der porösen Matrix umschlossen waren und eine glatte innere Oberfläche aufwiesen. Diese konnte mit Endothelzellen besiedelt und längerfristig kultiviert werden. Das schwammartige Kollagenmaterial war sehr gut zellverträglich und konnte ebenfalls erfolgreich mit verschiedenen Zelltypen besiedelt werden. Im histologischen Schnitt zeigten sich komplexe Gewebestrukturen, die dem Aufbau natürlicher Gewebe ähnelten.
In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass mit den komplexen, dreidimensionalen Kollagenscaffolds lebende, gewebe-ähnliche Strukturen erzeugt werden können. Die Scaffolds eignen sich damit als Gerüstmaterial für das Kultivieren von Zellen im Gewebeverbund. Die Scaffolds sollen jetzt in einen Bioreaktor eingesetzt und mit Hilfe der Versorgungskanäle perfundiert werden. Das Kollagenmaterial ist resorbierbar und könnte somit auch den Umbau sowie die Vaskularisierung der Gerüststruktur ermöglichen.
P62
Polyglycidol/Hyaluronsäure-basierte Hydrogele für das Tissue Engineering
*V. Schill1, T. Böck2, J. Teßmar1, T. Blunk2, J. Groll1
1Universitätsklinikum Würzburg, Abteilung für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde, Würzburg, Deutschland
2Universitätsklinikum Würzburg, Klinik und Poliklinik für Unfall-, Hand-, Plastische und Wiederherstellungschirurgie, Würzburg, Deutschland
Einleitung:
Hydrogele sind vernetzte, dreidimensionale Polymernetzwerke, die in der Lage sind, große Mengen an Wasser zu binden und als viskoelastischer Körper zu verfestigen. Mit diesen Eigenschaften ähneln sie der natürlichen Gewebematrix und können so beispielsweise in der regenerativen Medizin als Ersatz für defekte Organe oder Gewebe eingesetzt werden. Hierfür werden die synthetischen Hydrogele zusätzlich mit patienteneigenen Zellen besiedelt und diese zu einer natürlichen Matrixproduktion stimuliert. Geeignete Hydrogelsysteme für diese Anwendung müssen sowohl biokompatibel als auch biologisch abbaubar sein, und in ihren mechanischen Eigenschaften dem biologischen Gewebe entsprechen. Die erhaltenen Hydrogele sollen sowohl die Adhäsion, als auch die Migration und Differenzierung der verwendeten Zellen unterstützen.
Materialien und Methoden:
Für die hier untersuchte Hydrogelmatrix wurden sowohl der natürliche Bindegewebsbestandteil Hyaluronsäure als auch kurzkettige lineare Polyglycidole verwendet, die nach Thiol- bzw. Acrylatfunktionalisierung zur Bildung von Polymernetzwerken befähigt sind. Thiolfunktionalisierte Hyaluronsäure (HA-SH) wurde über eine EDC-Aktivierung der Carbonsäure und Anbindung von Dithiopropionsäurehydrazid synthetisiert.[1] Polyglycidol wurde anionisch polymerisiert[2] und anschließend mit Acrylsäureanhydrid zu P(ACR/G) umgesetzt. Um die Hydrogele zu erhalten, wurden P(ACR/G) und HA-SH in einer Michael-Addition in PBS bei pH 7.4 zellkompatibel vernetzt. Thiolhaltige Peptide und entsprechend modifizierte Wachstumsfaktoren (TGF-ß) wurden ebenfalls über eine Michael-Addition an P(ACR/G) gebunden. Mittels Oszillationsrheologie wurden die mechanischen Eigenschaften der sich vernetzenden Hydrogele charakterisiert.
Ergebnisse und Diskussion:
Die Eignung der Hydrogele für die Knorpelregeneration wurde durch Zellversuche mit chondrogen differenzierten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) nachgewiesen. In diesen Versuchen zeigte sich eine deutliche positive Wirkung des kovalent immobilisierten Wachstumsfaktors, der sogar den Einfluss des löslichen Faktors übertraf.
Referenzen:
[1] X. Z. Shu, Y. Liu, F. S. Palumbo, Y. Luo, and G. D. Prestwich, Biomaterials2004, 25, 1339.
[2] J. Groll, S. Singh, K. Albrecht, M. Moeller, Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry2009, 47, 5543.
P63
Enhanced cell migration capacity due to plasma-functionalization of calcium phosphate hybrid scaffolds
*H. Rebl1, C. Bergemann1, M. Cornelsen2, A. Quade3, T. Laube4, M. Schnabelrauch4, V. Weißmann5, H. Seitz2, B. Nebe1
1University Rostock Medical Center, Cell biology, Rostock, Deutschland
2University Rostock, Fluid Technology and Microfluidics, Rostock, Deutschland
3Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology (INP), Greifswald, Deutschland
4INNOVENT e.V., Biomaterials Department, Jena, Deutschland
5Institute for Polymer Technologies (IPT), Wismar, Deutschland
Introduction:
Infiltration of porous β-tricalcium phosphate (TCP) scaffolds with PLA can lead to improvement of compressive strength of calcium phosphate scaffolds. However, PLA surfaces are poorly occupied by human body cells. Therefore, the objective of this work was to optimize osteoblast migration and cellularization inside a three-dimensionally (3D) printed, PLA polymer stabilized TCP hybrid scaffold by a plasma polymer process depositing amino groups via allylamine.
Materials and Methods:
Porous scaffolds (5 μm in height) were produced from ß-tricalcium phosphate (TCP) using 3D-printing technology. TCP scaffolds were mechanically stabilized by infiltration with PLA. To improve the cell-attractive properties of PLA surfaces, functionalization with polymerized allylamine (PPAAm) was performed. For 2D-cell migration analyses human MG-63 osteoblasts were grown for 48 h on smooth material +/- PPAAm surfaces. For 3D-analyses two porous scaffolds were stacked horizontally, fixed within a clamping ring and integrated in a perfusion cell reactor. After 14 d of perfusion culture the cell density and vitality on every level was determined.
Results and Discussion:
PLA infiltration of TCP scaffolds resulted in a thin internal layer without sealing the macropores, leading to a 10-fold increase in compressive strength. The functionalization with allylamine was extremely successful with respect to the spreading capacity of osteoblastic cells and migration capacity. During migration cells left foot prints of fibronectin. For 3D-analyses the TCP/PLA scaffolds +/- PPAAm were seeded with osteoblasts on the top level, fixed inside the 3D model and cultivated (14d). Impressive cell ingrowth could be detected for PPAAm coated TCP/PLA scaffolds where cells proliferated and migrated through the pores (against the medium flow) to the bottom side of the scaffold. In contrast, on non-treated TCP/PLA scaffolds cells attached and proliferated on the top level only and did not migrate to the interior of the 3D model. Thus topographic elements such as interconnective porosity and optimum pore size alone are not sufficient to facilitate cell penetration into an artificial scaffold material. The supplementation of the scaffold with chemical cell-attracting components plays a major role in achieving complete cellularization of porous 3D-scaffold materials.
P64
Die mechanischen Eigenschaften von Hydroxyapatit (HAp) -Polycaprolactone (PCL) Biokomposite
The Mechanical Properties of Hydroxyapatite (HAp)-Polycaprolactone (PCL) Biocomposites
M. K. Keler1,2, O. Gunduz3, S. Daglilar2, N. Ekren4, *F. N. Oktar5
1SARKUSAN, 2Multiwire and Stranded Wire Department, Istanbul, Trkei
2Yildiz Technical University, Department of Metallurgical and Materials Engineering, Istanbul, Trkei
3Marmara University, Department of Metallurgical and Materials Engineering, Faculty of Technology, Istanbul", Trkei
4Marmara University, Department of Electrical and Electronic Engineering, Faculty of Technology, Istanbul, Trkei
5Marmara University, Bioengineering, Istanbul, Trkei
Abstract:
In den biomedizinischen Technik-Bereich, gibt es eine breite Nutzung polycopraloctone basierende Biokomposite. PCL zeigt hervorragende mechanische Eigenschaften in beiden Implantat design und Gewebe Engineering. Da die Material Biokompatibilität und Förderfähigkeit Bildung mit Hydroxyapatit hat diese Forschung durchgeführt einige gefördert Ergebnisse auf mechanische Seite der Verbundwerkstoffe. Polycaprolacton, Molekulargewicht 80.000 g/mol, von Sigma-Aldrich erworben und ohne weitere Behandlung verwendet. Polymere, die in Dimethylformamid (DMF) / Choloroform mit der w/w-Verhältnis von 50/50 zerlegt. Hydroxyapatit (HAp) wurde von den gleichen Sätzen mit PCL in experimentellen Teil unter Verwendung von Eisessig. HAp-PCL Composites Nanofasern wurden unter Verwendung von Elektrospinnverfahren hergestellt. Die angelegte Spannung zwischen 15 kV auf 31,8 kV. Eine neue Konstruktion von Multi-Fütterungssystem wurde fictionalized, um die Verbundfaser vorkommende im Rahmen herzustellen. Nach der Zeit der Herstellung wurde die mechanische alle Proben unter Verwendung von 1x5 cm rechteckigen Proben mit Instron 4411-Maschine durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß die erhöhte Prozentsätze der PCL in der Lösung eine bessere Umsetzung in tragenden Gewebezüchtung. Die Ergebnisse zeigen, daß die Kombination von HAp-PCL Kompositen Fasern ergibt dauerhafte Berichte, um sie in 3D-Gewebegerüste verwenden.
Einleitung:
Biowerkstoffe sind sehr wichtig, aufgrund der Alterung EU-Bevölkerung und Verkehrsunfälle. Seit vielen Jahren Biokeramik (dh HAp), Bioglass, metallic Materialien (Titan ) und viele Biopolymere (dh Chitosan ) wurden als Biomaterial verwendet . Kürzlich Elektrospinnen kommen in Frage zu stellen und mit dieser Technik ist es viel einfacher als die Herstellung von wiederherstellbar Gerüste. Durch die Herstellung wurden die Fasern auf Nano-Ebene produziert. Es ist bereits bekannt, daß Zellen, wie Nanostrukturen für die Heilung in einer viel kürzeren Zeit.
Material und Methoden:
Hier in dieser Studie als HAp Quelle Rindern HAp (BHAp) als biokeramisches Material verwendet. BHAP wurde durch Kalzinierung von Rinderknochen bei 850 ° C (Oktar FN2007) produziert. BHAP wurde mit PCL gemischt. Die angelegte Spannung zwischen 15 kV auf 31,8 kV. leitung
Ergebnisse und Diskussion:
Hier mechanischen Prüfungen wurden alle Proben unter Verwendung von 1x5 cm rechteckige Proben mit Instron 4411 - Maschine durchgeführt. Es zeigte sich, daß BHAp - PCL Stoffe lassen sich problemlos als neuartiges Gerüst für orthopädischen Verletzungen verwendet werden. Die Ergebnisse wurden mit den jüngsten Literatur verglichen, und es ist ersichtlich, daß BHAp - PCL Kompositen sind viel versprechende Biomaterialien für die nächsten Jahre.
Referenzen:
Oktar FN, Agathopoulos S, Ozyegin LS, Gunduz, O., Demirkol, N., Bozkurt, Y. Salman, S., ''Mechanical properties of bovine hydroxyapatite (BHA) composites doped with SiO2, MgO, Al2O3, and ZrO2'', Journal of Material Science - Materials in Medicine, Volume 18, Issue 11, pp. 2137-2143, 2007.
P65
Prävaskularisierung von Kollagenmatrices zur Generierung einer in vitro-Schleimhaut
*H.- K. Bauer1,2, M. Heller1,3,2, E. Frerick-Ochs 1, D. Flesch1, C. Pfeifer1, J. Brieger3,2, R. Stein1, B. Al-Nawas4, C. Brochhausen5,2, J. Thüroff 1, R. Unger5,2, W. Brenner1,2
1Universitätsmedizin, Urologie, Mainz, Deutschland
2BiomaTiCS, Biomaterials, Tissues and Cells in Science, Mainz, Deutschland
3Universitätsmedizin, Hals-, Nasen- und Ohrenklinik, Mainz, Deutschland
4Universitätsmedizin, Klinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie, plastische Operationen, Mainz, Deutschland
5Universitätsmedizin, Institut für Pathologie, Mainz, Deutschland
Einleitung:
Autologe, mittels „Tissue Engineering“ hergestellte Gewebe gewinnen derzeit in der regenerativen edizin eine immer größere Bedeutung, da nach größeren chirurgischen Eingriffen - wie Tumorentfernungen oder der operativen Rekonstruktion von Fehlbildungen - häufig großflächige Wunden geschlossen werden müssen. Bisherige, durch „Tissue Engineering“ generierte Gewebe bieten in vielen Bereichen noch keine zufriedenstellenden Lösungen. Problematisch bei der Verwendung solcher Konstrukte ist die mangelnde und/oder nicht zeitnahe Vaskularisierung, die häufig zu Nekrosen und einer Abstoßung des Transplantats führt. Um dieser Problematik zu begegnen etablierten wir prävaskularisierte Schleimhaut-Äquivalente mit Hilfe von mikrovaskulären Endothelzellen in Trikultur mit Epithelzellen und Fibroblasten.
Materialien und Methoden:
Zur Generierung prävaskularisierter Schleimhaut-Äquivalente analysierten wir sechs verschiedene Biomaterialien auf ihre Kompatibilität (BioGide, BioGidePro, TissuDura, TissuFoil, MucoGraft und Surgisis ES). Beurteilt wurde ihre Größenentwicklung und Sensitivität gegenüber Manipulationen sowie ihr Effekt auf die Entwicklung einer Trikultur. Für diese Trikulturen wurden autologe primäre Zellen verwendet: humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC), aus Mundschleimhaut isolierte Epithelzellen und Fibroblasten. Die analysierten Biomaterialien wurden in Membranen mit 6 mm² Durchmesser präpariert und mit den genannten Zellen besiedelt. Nach 21 Tagen Kultivierung wurden die Membranen konfokalmikroskopisch und immunhistochemisch bzgl. verschiedener Differenzierungsmarker (CD31, Zytokeratin-13, Kollagen IV) der verwendeten Zellen analysiert sowie die Bildung kapillar-ähnlicher Strukturen begutachtet. Die Vitalität der Zellen wurde mittels MTT-Assay überprüft. Zudem wurden pro-angiogene Wachstumsfaktoren im Überstand der Trikultur identifiziert.
Ergebnisse und Diskussion:
Im Vergleich der verschiedenen Matrices konnten BioGide und BioGidePro als geeignete Scaffolds selektiert werden. Die natürliche BioGide Matrix war gegenüber der stark vernetzten BioGidePro von Vorteil, was wir auf eine höhere zelluläre Sekretion an Wachstumsfaktoren wie PDGF, IL-8 und Angiopoietin zurückführen konnten. In Trikulturen aus Endothelzellen, Epithelzellen und Fibroblasten gelang es uns, auf biologischen Scaffolds prävaskularisierte Schleim¬haut-Äquivalente zu generieren. Wir erreichten eine dichte Bildung Kapillar-ähnlicher Strukturen, eine durch¬gängige Epithelschicht auf der Oberseite der verwendeten Matrices und eine tiefe Invasion von Fibroblasten in diese. Die Kapillar-ähnlichen Strukturen korrelierten positiv mit der eingesetzten Zellzahl und wiesen Durchmesser von 10-30 μm auf, was der Größe natürlicher Kapillaren entspricht. Die durchgehende Bildung Kapillar-ähnlicher Strukturen könnte die vaskuläre Anbindung autologer Transplantate deutlich beschleunigen und ihre Versorgung garantieren. Dadurch könnten die Erfolgschancen künstlicher Gewebe drastisch gesteigert werden.
P66
Multiphotonentomographie - Bildgebendes Verfahren mit Potenzial für Diagnostik und Tissue Engineering: Machbarkeitsuntersuchung zur Visualisierung der Schleimhaut
*D. Linde1, L. Schreier2, T. Granitzka1, S. Voigt1, K. Otto1, T. Fischer1, M. Zieger1, A. Gebert1, G. Schneider1
1Universitätsklinikum, Jena, Deutschland
2Ernst-Abbe-Hochschule, Jena, Deutschland
Einleitung:
Die Multiphotonentomographie ist ein Bildgebungsverfahren, das auf Fluoreszenzanregung durch jeweils zwei oder mehr Photonen langwelligen Lichts basiert. Unter Nutzung endogener Fluorophore ermöglicht sie die nicht-destruktive Echtzeit-Visualisierung lebendiger Gewebe ohne Anfärbung bzw. Markierung mit fluoreszierenden Farbstoffen. In der Dermatologie ist die Multiphotonentomographie zur nichtinvasiven Erzeugung von Serien virtueller horizontaler in vivo-Schnittbilder der Haut bereits in der klinischen Forschung erprobt.
Ziel war die Testung der Anwendbarkeit der Multiphotonentomographie auf die Charakterisierung von Schleimhaut aus dem Kopf-Hals-Bereich.
Materialien und Methoden:
Nach Entwicklung eines Messaufbaus zur Untersuchung von Proben der menschlichen Schleimhaut erfolgte die vergleichende Visualisierung von je vier ex vivo-Proben mit zwei qualitativ unterschiedlichen Multiphotonentomographen:
Das DermaInspect® (JenLab GmbH, Jena) ist ein speziell auf die in vivo-Untersuchung der menschlichen Haut ausgerichtetes Gerät, mit dem darüber hinaus u.a. auch ex vivo-Gewebeproben untersucht werden können (1,2). Es wird insbesondere zur Diagnose von Hautkrankheiten eingesetzt.
Das LSM 7 MP (Carl Zeiss AG, Oberkochen) ist ein leistungsfähiges, flexibel konfigurierbares Forschungsgerät, das Untersuchungen von ex vivo-Gewebeproben, in vitro-Gewebekulturen sowie die in vivo-Bildgebung an Kleintieren ermöglicht.
Nach der Untersuchung mit diesen Multiphotonentomographen wurden die Proben zum Vergleich mittels Kryo- bzw. Paraffinschnitten histologisch evaluiert. Die Bewertung der visualisierten Strukturen erfolgte mit Hilfe eines Systems dafür definierter Scores.
Ergebnisse und Diskussion:
Der entwickelte Messaufbau erlaubte die ex vivo-Darstellung von Substrukturen lebendiger Schleimhaut. Zellen konnten mit den Multiphotonenmikroskopen im Zellverband mit zellulären Strukturen und extrazellulärer Matrix visualisiert werden. Beide im Test verwendete Multiphotonenmikroskope eigneten sich gut zur Darstellung intakter Zellverbände und des physiologischen Schichtaufbaus des Schleimhaut-Epithels (Abb. 1-3). Im Unterschied zu den Ergebnissen der Histologie zeigte sich allerdings, dass eine Visualisierung der Basalmembran und die Differenzierung verschiedener Zellarten nur eingeschränkt realisierbar waren (Tab. 1).
Über die in der Dermatologie bereits etablierten klinischen Anwendungen hinaus hat die Multiphotonentomographie interessante Potenziale nicht nur als Verfahren für klinische Diagnostik, Verlaufskontrolle und intraoperatives Monitoring, sondern insbesondere auch als nichtdestruktives Echtzeit-Bildgebungsverfahren zur Charakterisierung von in vitro-Gewebekulturen (2). Um ihre Eignung für die Bearbeitung der jeweiligen konkreten Fragestellungen zum Beispiel im Bereich des Tissue Engineerings beurteilen zu können, ist die vorherige Durchführung praxisrelevanter Tests empfehlenswert.
Referenzen:
(1) Klinger A et al. (2012) Histochem. Cell Biol. 137(3): 269-278
(2) Schenke-Layland K et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(7): 878-896
P67
Vernetzte Hydrogele als potenzielles Werkzeug für den Weichgewebsersatz
*L. Kessler1, B. Huber2, E. Hoch2, T. Walter3, R. Wyrwa3, M. Schnabelrauch3, M. Becerikli1, M. L. Schmidt1, T. Hirsch1, F. Jacobsen1
1Ruhr-Universität Bochum, Universitätsklinik für Plastische Chirurgie und Schwerbrandverletzte, BG Universitätskliniken Bergmannsheil, Bochum, Deutschland
2Universität Stuttgart, Institut für Grenzflächenverfahrenstechnik und Plasmatechnologie, Stuttgart, Deutschland
3Innovent e.V, Abteilung für Biomaterialien, Jena, Deutschland
Einleitung:
Hydrogele werden schon seit Jahrzehnten im klinischen Alltag verwendet und besonders in der Wundbehandlung werden ihre Fähigkeiten geschätzt. In der Forschung drehen sich einige Ansätze des Tissue Engineerings um diese Art von Gelen und es konnten bereits einige Erfolge erzielt werden. Mit Hydrogelen aus methacrylierte Gelatine, Hyaluronsäure und adipogenen Stammzellen (ASCs) könnten neue Methoden entwickelt werden Weichteildefekte zu behandeln. Diese Studie untersuchte solche Hydrogelen und ihren Einfluss auf die Vitalität, Proliferation und Differenzierung der adipogenen Stammzellen.
Methoden:
Methacrylierte Gelatine und Hyaluronsäure wurden mittels Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) zu formstabilen Hydrogelen vernetzt. Zu Beginn wurde die Zytotoxizität des Photoinitiators getestet und die Wasserabsorptionsfähigkeit der Hydrogele untersucht. In Hydrogele mit unterschiedlichen Gelatine-anteilen (4%, 5% oder 10%) wurden, aus humanen Fettgewebe isolierte, adipogene Stammzellen (ASCs) für die Versuche eingearbeitet oder auf ihnen ausgesät. Die Vitalität und Proliferation der Zellen wurden dann mit Hilfe eines colorimetrischen Vitaliätsassay (Alamar Blue) über 21 Tage untersucht. Durch Stimulation mit einem etablierten Differenzierungsmedium (ADM) wurden die Stammzellen in den Hydrogelen in reife adipozyten differenziert und fluoreszenz-mikroskopisch analysiert (AdipoRed/Fluoresceindiacetat/Hoechst 33342 und Calcein/Propidiumjodid). Darüberhinaus wurden durch ein Tube-formation Assay mit humanen Endothelzellen (HUVEC) getestet, ob sich die Hydrogele zur in-vitro Angiogenese eignen bzw. ob sie für Angiogenese optimiert werden kann.
Ergebnisse:
Der LAP Photoiniator zeigte keinen zytotoxischen Einfluss auf ASCs. Gele aus Gelatine und Hyaluronsäure wiesen eine signifikant erhöhte Wasserabsorption im Vergleich zu Gelatine Gelen auf (p Durch Differenzierungsmedium konnten ASCs innerhalb des Hydrogel in reife Adipozyten differenziert werden. Trotz vielversprechender Proliferations- und Vitalitätsdaten konnte keine in-vitro Angiogenese gezeigte werden, jedoch konnte eine Verbesserung durch Hinzufügen von Fibrin erreicht werden.
Diskussion:
Wir konnten zeigen, dass Hydrogele aus den von uns verwendeten Komponenten sich als vielversprechender Ansatz für das Tissue Engineering von Weichgewebe darstellen. Sie erfüllen einige Kriterien für eine passende Matrix Umgebung der ASCs. Besonders die Kombination von Gelatine und Hyaluronsäure steigert die Vitalität der Zellen. Diese Gele konnten auch wesentlich mehr Flüssigkeit absorbieren und somit auch Nährstoff aus dem Medium, was auch die Differenzierung der Zellen positiv beeinflussen könnten. Kritisch für einen suffizienten Weichgewebsersatz ist Vaskularisierung die einen kontinuierlichen Nähstofftransport gewährleistet. Unsere Hydrogele müssten für eine intrinischen Vaskularisierung noch um andere Komponenten, wie Fibrin, erweitert werden.
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