Young Scientist Forum

De Gruyter | Published online: October 5, 2015

V13

Freisetzung von Therapeutika für Knochenerkrankungen aus oberflächengebundenen Polyelektrolytkomplexen

*D. Vehlow1, R. Schmidt2, M. Siebert3, K. Lips3, A. Gebert2, M. Müller1,4

1Leibniz Institut für Polymerforschung Dresden e.V., Polyelektrolyte und Dispersionen, Dresden, Deutschland

2IFW Dresden, Dresden, Deutschland

3Justus Liebig Universität, Gießen, Deutschland

4Technische Universität, Dresden, Deutschland

Einführung:

Die lokale Funktionalisierung von Knochenersatzmaterialien (KEM) mit Drug-Delivery-Systemen ist relevant für Frakturheilung und Geweberegeneration im systemisch erkrankten Knochen (Osteoporose, Multiples Myelom). Es wird gezeigt, wie KEM und Modellsubstrate mit etablierten Polyelektrolytkomplex-Nanopartikeln (PEK-NP) [1] beschichtet und daraus Arzneistoffe (AS) verzögert freigesetzt werden können, um deren Effizienz zu steigern und Nebenwirkungen zu unterdrücken.

Materialien & Methoden:

Aufbauend auf bisherigen Arbeiten [2] wurde eine verbesserte Präparationsmethode für AS/PEK-NP ausgearbeitet. Kationisches Poly(L-Lysin) (PLL) wurde mit einem Gemisch aus anionischen Cellulosesulfaten (CS) mit niedrigem und hohem Sulfatgehalt komplexiert, damit CS- und PLL-Lösung eine möglichst gleiche molare Ladungskonzentration haben [3]. Das Bisphosphonat Risedronat (RIS) und das Antibiotikum Rifampicin (RIF) wurden ladungsgemäß integriert. Durch Zentrifugation, Überstand-Dekantieren und Pellet-Isolierung wurden überschüssiges PK oder PA und ungebundener AS abgetrennt.

Die Charakterisierung der AS/PEK-NP-Dispersionen und -Schichten erfolgte über Kolloidtitration, dynamische Lichtstreuung, mikroskopische und spektroskopische Techniken (FTIR, UV-VIS) hinsichtlich Nettoladung, Partikelgröße, Morphologie, Zusammensetzung und AS-Gehalt. Konzentrationen von Osteocalcin und Calcium in Zellmedien (hMSC aus Knochenbohrmehl) über AS/PEK-NP-Schichten wurden über Standardtests (ELISA) bestimmt.

Ergebnisse:

Die neue Präparationsmethode bringt drei wichtige Vorteile: Zugang zur AS-Beladung der dispergierten PEK-NP (AS-Konzentration im Überstand) (i), adhäsive Stabilität (kein PLL- oder CS-Überschuss) am KEM (ii), geringerer Initial-Burst und höherer Restgehalt (kein ungebundener AS) (iii). pH-Wert und Ionenstärke üben deutliche Effekte auf Beladung und Freisetzung von RIS und RIF aus. Das Freisetzungsverhalten am Substrat eines KEM (Ti/Nb-Legierung) und am Modellsubstrat ist ähnlich. Untersuchungen an hMSC zeigen deutliche Effekte des aus PEK-NP freigesetzten Risedronats auf den Osteocalcin- und Calcium-Spiegel im Zellmedium.

Referenzen:

[1] Adv. Pol. Sci. 255, 256, 2014

[2] Biointerphases 2013,8:25

[3] D. Vehlow, Masterarbeit, 2014

V14

Sustained release of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) from nanoporous silica nanoparticles and collagen matrices for tooth regeneration

*A. Satalov1, P. Behrens1, M. Steindorff2, E. Gellermann2, H. Hartwig2, A. Winkel2, M. Stiesch2

1Leibniz Universität Hannover, Institut für anorganische Chemie, Hannover, Deutschland

2Medizinische Hochschule , Klinik für zahnärztliche Prothetik und biomedizinische Werkstoffkunde, Hannover, Deutschland

Introduction:

Tooth regeneration is considered as a promising therapeutic approach in dental tissue engineering. For successful fabrication of appropriate biocomposites, stem cells, biomaterials, and physio-biochemical factors have to be combined. Among these materials, collagen scaffolds are very promising, e.g. the collagen type I, as it is a part of the extracellular matrix in bone and tooth tissue.[1]

Additionally, nanomaterials such as nanoporous silica can be used to construct nanocomposites with enhanced properties. Furthermore, nanoporous silica nanoparticles (NPSNPs) with large pore volume, high specific area and tunable surface chemistry have been proven to be effective drug delivery systems for a variety of therapeutic agents and for biomolecules.[2] Such bioactive molecules, e.g. growth factors, can, in principle, be used to promote the differentiation and proliferation of the cells.[3]

Materials and Methods:

In the current study, we investigated the release of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) from two samples consisting of (1) BMP-2 adsorbed on the surface of nanoporous silica nanoparticles and (2) BMP-2 loaded nanoporous silica nanoparticles embedded in a collagen matrix. First, the particles were loaded with 5 μg ml–1 BMP-2 in PBS / 0.1% BSA by diffusional loading at 4 °C overnight. After the protein loading one part of silica nanoparticles was subsequently combined with a collagen matrix by immersing into the nanoparticle suspension for 24 hours. The release of BMP-2 was carried out in PBS / 0.1% BSA, in a convection oven at 37 °C. The release medium was refreshed every 24 hours. The amount of immobilized BMP-2 and the release profiles were determined by ELISA. In addition, relative viability of dental pulp stem cell in the presence of 1000 ppm of the NPSNPs with different modifications and a similar amount of dissolved BMP-2 was studied.

Results and Discussion:

It was found that almost all BMP-2, namely about 99.9% of the total input, was adsorbed on the surface of both types of NPSNPs. All samples showed a sustained release of BMP-2, where amino-modified NPSNPs demonstrate a faster BMP-2 release than non-modified silica nanoparticles. In addition, cell culture investigations revealed that all tested types of NPSNPs are non-toxic to dental pulp stem cells, and hence can be used for further research. Moreover, successful fabrication of nanocomposite structures between collagen and NPSNPs was achieved.

References:

[1] Y. Sumita et al., Biomater.2006, 27, 3238.

[2] V. Mamaeva et al., Adv. Drug Delivery Rev.2013, 65, 689.

[3] A. Neumann et al., RSC Adv. 2013, 3, 24222.

Figure 1

Figure 1

Figure 2

Figure 2

V15

Calcium phosphate nanoparticles as delivery system for proteins across the cell membrane of living cells

*M. Nitschke1, O. Rotan1, K. Severin2, S. Pöpsel2, M. Ehrmann2, M. Epple1

1Universität Duisburg-Essen, Inorganic Chemistry and Centre for Nano Integration Duisburg-Essen (CeNIDE), Essen, Deutschland

2Universität Duisburg-Essen, Centre for Medical Biotechnology (ZMB), Essen, Deutschland

Introduction:

The transport of bioactive and biomedically relevant proteins across the cell membrane into living cells is still a challenge in biomedical research. Calcium phosphate nanoparticles are good carriers due to their good biocompatibility and biodegradability to transport (bio-)molecules across the cell membrane.1 Functionalized calcium phosphate nanoparticles were used to deliver proteins into the cytosol of different cell lines. This approach offers the possibility to address intracellular targets, e.g. receptors and enzymes.

Materials and Methods:

Two types of calcium phosphate nanoparticles were synthesized and colloidally stabilized with the polyelectrolytes polyethylenimine (PEI) or carboxymethylcellulose (CMC). The particles were loaded with different proteins and applied to the HeLa, MG-63, THP-1 and hMSC cells. They were characterized by DLS and SEM. The protein concentration on the nanoparticles was quantified by UV-spectroscopy. Uptake studies were performed for up to 48 h and analysed by UV-, fluorescence or confocal laser scanning microscopy. Uptake pathway mechanisms were examined by selectively blocking endocytosis pathways.

Results and Discussion:

The proteins were easily transported by calcium phosphate nanoparticles into the cells, although some cell lines were able to take up some proteins without nanoparticles. CLSM images showed the uptake of the nanoparticles together with the proteins by endocytosis as a function of time. The inhibition of different endocytosis pathways by specific inhibitors demonstrated that the uptake processes are different for nanoparticles and proteins. After cellular uptake, the nanoparticle end up first in an endosome and then in a lysosome where the acid-soluble calcium phosphate dissolves and the protein cargo is released. Both PEI and calcium phosphate are able to increase the osmotic pressure inside the lysosome, leading to early endosomal escape ("proton sponge effect").2,3

Conclusion

Calcium phosphate nanoparticles are able to deliver proteins into cells. Especially in cases where proteins alone are not able to penetrate the cell wall, they are suitable carriers to transport both synthetic and biological molecules into a cell.

Acknowledgement:

We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1093) for generous support.

References:

1. V. Sokolova et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 1382.

2. O. Rotan et al., Mater.-wiss. u. Werkstofftech., 2013, 44, 176.

3. V. Sokolova et al.,J. Nanopart. Res., 2012, 14, 910.

V16

Methodische Evaluierung der MRT-basierten Volumenbestimmung von Hydrogelen in vivo mittels CT Bildgebung ex vivo

*C. Tondera1,2, S. Ullm1,2, S. Meister1, T. P. Gebauer3, A. T. Neffe3, A. Lendlein3, J. Pietzsch1,2

1Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, Institut für Radiopharmazeutische Krebsforschung, Dresden, Deutschland

2Technische Universität Dresden, Fachrichtung Chemie und Lebensmittelchemie, Dresden, Deutschland

3Helmholtz-Zentrum Geesthacht, Institut für Biomaterialforschung und Berlin-Brandenburger Centrum für Regenerative Therapien, Teltow, Deutschland

Einleitung:

Sowohl in der Klinik als auch in der medizinischen Forschung sind Hydrogele vielfältig eingesetzte Biomaterialien. Großes Interesse besteht dabei an einer exakten nicht-invasiven Bestimmung des Abbauverhaltens in vivo. Da Hydrogele vorwiegend aus Wasser bestehen bietet sich dazu prinzipiell die Magnetresonanztomographie (MRT) an. Aufgrund des hohen Wasseranteils umliegender Gewebe ist jedoch der Nachweis einer engen Korrelation zwischen dem im MRT gemessenen und dem tatsächlichen Volumen der Hydrogele erforderlich.

Materialien und Methoden:

Es wurden zwei unterschiedlich stark quervernetzte Gelatine-basierte Hydrogele verwendet. Die Quervernetzung erfolgte mittels 3- (CO3) oder 8-fachem (CO8) Überschuss an Ethyllysindiisocyanat. Die Implantation der Hydrogele erfolgte subkutan in SKH1-Mäuse. Zur Bestimmung des Volumens in vivo wurde ein 7 T Kleintier-MRT mit einer T2-gewichteten Messsequenz verwendet. Nach Messung der Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten post implantationem erfolgte die Tötung und Gewebeentnahme einschließlich des Hydrogels. Die Gewebe wurden in Paraformaldehyd fixiert und in Ethanol dehydriert. Danach erfolgte die Färbung in Phosphorwolframsäure (PWS) für 49 Tage mit anschließender Visualisierung mittels Computertomographie (CT). Die Quantifizierung erfolgte mit Hilfe des Programms ROVER.

Ergebnisse und Diskussion:

Sowohl CO3 als auch CO8 konnten mit Hilfe der MRT in vivo sichtbar gemacht werden. Aufgrund des hohen Wassergehaltes der Hydrogele zeigen sie im MRT ein stärkeres Signal als umliegendes Weichgewebe. Für die nachfolgende CT-Messung dient PWS als Kontrastmittel, welches Fibrin, Kollagen und Gelatine bindet. Sowohl die MRT- als auch die CT-Messungen ermöglichen eine Quantifizierung der Hydrogel-Volumina. Die mit den beiden Methoden erhobenen Volumina korrelierten stark (r=0,9691, P<0,0001). Die MRT-Messung konnte somit mittels CT-Messung ex vivo verifiziert werden. Es kann geschlussfolgert werden, dass die nicht-invasive Volumenbestimmung mittels MRT ein geeignetes Verfahren für die Charakterisierung des Abbauverhaltens Gelatine-basierter Hydrogele darstellt.

Danksagung:

Die Autoren danken der Helmholtz-Gemeinschaft für die Förderung über das Helmholtz-Portfolio Thema "Technologie und Medizin - Multimodale Bildgebung zur Aufklärung des In-vivo-Verhaltens von polymeren Biomaterialien".

V17

Keramisierte Magnesium-Scaffolds mit verschiedenen Kanalstrukturen auf Mikrometerebene zur Rekonstruktion von knöchernen Defekten: Eine Untersuchung in vitro und vorläufige in vivo-Ergebnisse

*O. Jung1, P. Hartjen1, A. Kopp2, C. Ptock2, D. Porchetta2, H. Hanken1, R. Smeets1

1Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Klinik und Poliklinik für Mund-, Kiefer und Gesichtschirurgie, Hamburg, Deutschland

2Meotec GmbH & Co. KG, Aachen, Deutschland

Einleitung:

Der Einsatz biokompatibler- und resorbierbarer Magnesiumimplantate als Knochenersatzmaterial würde die Frage um die Explantation von nicht-resorbierbaren Implantaten in einer zweiten Operation umgehen. Zur Einstellung der Degradation und somit verzögerten H2-Freisetzung wurden die in dieser Studie verwendeten Implantate mittels plasmaelektrolytischer Oxidation (PEO) beschichtet sowie durch funkenerosive Bearbeitung auf Mikrometerebene verschieden kanüliert, um eine ausreichende Vaskularisation zu gewährleisten. In vitro und in vivo wurden PEO-beschichtete und unbeschichtete Implantate bezüglich Zytokompatibilität, Knochenregeneration und Osseointegration beurteilt.

Materialien und Methoden:

Die verwendeten WE43-Prüfkörper wurden mittels Funkenerosion strukturiert und in verschiedenen Elektrolytkompositionen PEO beschichtet. Nach der Oberflächenanalyse mit REM, EDX und Profilometrie wurde die Degradation in einem eigens konzipierten Degradationstand ermittelt. Gemäß den Ergebnissen der in vitro-Zytokompatibilität (DIN ISO 10993-5/-12) wurde die favorisierte Schicht in vivo evaluiert. Hierzu wurden 0,4 bis 0,8 mm kanülierte Implantate transkortikal in die Femora von 60 New Zealand white Rabbits eingebracht und das Degradationsverhalten begleitend im CT festgehalten. Nach Euthanasie der Tiere an den Zeitpunkten 6 und 12 Monate wurden die Knochenregeneration sowie Osseointegration histologisch beurteilt.

Ergebnisse:

In vitro konnte eine Schichtvariante gleiche Zytokompatibilitäten wie die Titanreferenz in den XTT-, BrdU- und LDH-Assays aufzeigen. In Vitalfärbungen zeigten sich die L929-Fibroblasten vital, adhärent und spindelförmig. Die Degradationsraten waren im Vergleich zu unbeschichteten Proben signifikant niedriger. In vivo (Stand: 5 Monate) zeigte sich eine insgesamt niedrige H2-Freisetzung bei stabilen Magnesiumprüfkörpern. Diese wurden von den Kaninchen gut toleriert.

Schlossfolgerung/Diskussion:

Neben der erfolgreichen Herstellung der keramisierten Magnesiumimplantate mit kanülierter Mikrostruktur konnten diese exzellente in vitro-Zytokompatibilitäten und vielversprechende in vivo-Biokompatibilitäten aufzeigen. Dabei war es durch den eigens konzipierten Degradationsstand möglich, die H2-Fresietzung genau zu bestimmen.

V18

Neuartige keramische Schaumstrukturen für individualisierten Knochenersatz

*M. Ahlhelm1, P. Günther2, U. Scheithauer1, H. Lausch1, T. Moritz1

1Fraunhofer IKTS, Dresden, Deutschland

2Hochschule Koblenz, WesterWaldCampus, Höhr-Grenzhausen, Deutschland

Einleitung:

Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten unterschiedlichste Biomaterialien mit spezifischer Gestalt und definierten Porositäten herzustellen. Methoden wie die Pressformgebung, PIM (Powder Injection Molding) und MIM (Metal Injection Molding) sind meist auf die Herstellung dichter Strukturen ausgerichtet. Gradierte und poröse Formkörper indes, können bspw. über Schlickergießen, vor allem aber über allgemein bekannte Schäumungsmethoden (Replica-, Platzhaltermethode, Direktschäumung) hergestellt werden. Aktuelle Forschungsaktivitäten favorisieren Additive Fertigungsmethoden, mit denen es gelingt, reproduzierbare komplexe, drei-dimensionale dichte oder gezielt poröse Strukturen herzustellen.

Materialien und Methoden:

Dieser Beitrag stellt co-gefertigte keramische Kompositstrukturen vor, welche die Vorteile konventioneller bzw. additiver Fertigungsmethoden mit denen eines Schaumherstellungsverfahrens vereinen. Damit gelingt die Herstellung neuartiger keramischer Schaumstrukturen, die als Knochenersatzmaterial anwenderspezifisch individualisiert werden können.

Ergebnisse und Diskussion:

So wurden keramische Komposit-Strukturen aus ZrO2 hergestellt, die ähnlich einem realen Knochen, außen eine dichte Hülle und im Innern eine offenporöse Schaumstruktur aufweisen. So erlaubt hier das LCM-Verfahren (Lithography-based Ceramic Manufacturing) einerseits die Herstellung einer reproduzierbaren Außenkontur, die angepasst an die jeweilige Anwendung, spezifische und lokale Oberflächenmodifikation erlaubt. Andererseits gestattet das poröse innere, nachweislich ein An-/Durchwachsen von Zellmaterial. Erste Ergebnisse von CT (Computertomographie)-Aufnahmen zeigen einen meist vollständigen, mindestens aber teilweise bestehenden Form- und Materialschluss zwischen den unterschiedlichen Porositätsbereichen. Porengrößenverteilungen erlauben Rückschlüsse auf vorhandene Porosität und Porengrößen und somit auch indirekt auf die Biokompatibilität. Eine Steigerung der Biointegration hergestellter Strukturen kann durch die Verwendung diverser Drug Delivery Systeme, ausgehend von dem porösen, aber auch dem lokal modifizierbaren dichten Bereich der Kompositstrukturen, erfolgen. Unter Verwendung geeigneter Materialien sind schließlich auch resorbierbare porös-dichte Strukturen denkbar.

V19

3D porous scaffolds for tissue engineering: morphology and influence of pore sizes

*C. Hege1,2,3, S. Proksch4, R. Jäger5, S. Schiller6,2

1Fraunhofer IOSB, Ettlingen, Deutschland

2University of Freiburg,, Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), Freiburg, Deutschland

3University of Freiburg, IMTEK, Department of Microsystems Engineering, Freiburg, Deutschland

4University Medical Center Freiburg, Dental School and Hospital, Freiburg, Deutschland

5Fraunhofer IWM, Freiburg, Deutschland

6University of Freiburg, Center for Biosystems Analysis (ZBSA), Freiburg, Deutschland

Introduction:

Tissue engineering requires mimicking the Extracellular Matrix (ECM) for providing cells with an instructive and defined microenvironment. In order to achieve this goal we developed porous 3D scaffolds made of biodegradable polymers.

Materials and Methods:

The scaffolds are produced out of biodegradable polymers by a porogen leaching approach combined with a phase separation approach. The scaffolds were analyzed with SEM and light microscopy. The preferences of human periodontal fibroblasts towards the pore sizes were examined by in vitro cell tests. Also degradation studies and mechanical tests were performed to examine the influence of pore sizes.

Results and Discussion / References:

With the porogen approach big pores can be produced, the phase separation leads to small interconnected pores. Pore sizes from 125 - 1250 μm can be easily generated.

The polymer the scaffold was made of influences the morphology of the scaffolds. The pore size influences the mechanical stability as well as degradation of the scaffolds. The human periodontal fibroblasts prefer the smaller pores.

V20

Reduzierte mikrobielle Adhäsion auf nanostrukturierten Biomaterialoberflächen

*C. Dewald1,2,3, C. Lüdecke1, M. Roth2,3, J. Bossert1, K. D. Jandt1,2

1Friedrich-Schiller-Universität Jena, Lehrstuhl für Materialwissenschaft, Jena, Deutschland

2Friedrich-Schiller-Universität Jena, Jena School for Microbial Communication (JSMC), Jena, Deutschland

3Leibniz-Institut für Naturstoffforschung und Infektionsbiologie, Hans-Knöll-Institut (HKI), Bio Pilot Plan, Jena, Deutschland

Einleitung:

Die steigenden Zahlen von Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI) und multiresistenten Mikroorganismen sind in vielen Ländern ein verbreitetes Problem. Aus diesen Gründen wird nach alternativen, antibiotikafreien Strategien geforscht, um die Adhäsion von Mikroorganismen auf Biomaterialien und demzufolge BAI zu reduzieren. Ein Ansatz ist dabei, die Topografie der Biomaterialoberfläche zu modifizieren. Die Verwendung von Nanopartikeln zur Nanostrukturierung von Biomaterialoberflächen ist eine vielversprechende Methode. Ziele dieser Arbeit sind (i) die Untersuchung von Escherichia coli auf Biomaterialien, die mit Nanopartikeln strukturiert wurden und (ii) die Mechanismen mikrobieller Adhäsion zu identifizieren und zu verstehen.

Materialien und Methoden:

Goldoberflächen wurden mittels physikalischer Gasphasenabscheidung hergestellt. Verschiedene Konzentrationen von funktionalisierten Nanopartikeln wurden auf Polyethylenimin-funktionalisierten Goldoberflächen immobilisiert. Die Charakterisierung nanostrukturierter Biomaterialoberflächen erfolgte mittels atomarer Rasterkraftmikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Kontaktwinkelmessung. E. coli Zellen adhärierten auf den modifizierten Goldoberflächen sowie auf Kontrollproben ohne Nanopartikel und wurden mittels eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM) analysiert. Das Schneiden von anhaftenden Bakterienzellen mittels eines fokussierten Ionenstrahl-REM führte zur detaillierten Betrachtung der Nanogrenzfläche zwischen Zelle und Biomaterial.

Ergebnisse und Diskussion:

Zu allen Zeitpunkten (3 h, 6 h, 9 h) ist der Bedeckungsgrad auf den nanostrukturierten Goldoberflächen signifikant geringer als auf der Kontrollprobe. Zudem wurde eine verringerte Adhäsion von E. coli Zellen durch die reduzierte Anzahl von gebundenen Nanopartikeln auf der Goldoberfläche erzielt.

Mit der verringerten Menge an Nanopartikeln wird der Abstand zwischen ionisch gebundenen Nanopartikeln auf der Goldoberfläche vergrößert. Der erste Kontakt der Bakterienzellen mit den Goldoberflächen sind die gebundenen Nanopartikel, die als Anhaftungspunkte fungieren. Nimmt die Anzahl von Anhaftungspunkten verglichen zur Größe des Bakteriums ab, so ist die Anhaftung verringert.

Diese Untersuchungen geben neue mechanistische Aufschlüsse über die Interaktionen von Bakterienzellen mit Biomaterialoberflächen. Die Veränderung der Nanostruktur auf Biomaterialoberflächen beeinflusst die mikrobielle Adhäsion von E. coli und hat zugleich Potenzial, das Risiko einer BAI zu reduzieren.

In der gezeigten Studie wurde eine Biomaterialoberfläche mit Nanopartikeln nanostrukturiert. Eine geringere Menge an gebundenen Nanopartikeln reduzierte die Anhaftungspunkte für Bakterien und führte zu einer verringerten mikrobiellen Adhäsion.

V21

Dual setting calcium phosphate/fibroin cements

*M. Geffers1, T. Christel1, J. Groll1, U. Gbureck1

1Universität Würzburg, FMZ, Würzburg, Deutschland

Introduction:

Calcium phosphate cements (CPC) set by a dissolution-precipitation-reaction in an aqueous environment to form brushite1 or monetite2 at acidic conditions. These CPCs are rapidly resorbable under physiological conditions, but suffer from their brittle character and low mechanical performance. Here we developed a dual setting system by combining CPC with silk fibroin (SF)3 to enhance the mechanical and biological properties.

Materials and Methods:

For the SF-solution silk cocoons were boiled, dissolved in 9 M LiBr, dialyzed against water and PEG (20000) for final concentrations of 4, 8 and 16 wt.-%. The cement pastes were formed by mixing CPC powder and SF solution in a ratio of 0.5 or 1 g/ml. Cement characterization was performed by XRD, FT-IR, SEM and mechanical testing. Cements were cultivated with MG-63 cells for 14 d and their proliferation and activity was measured. Additionally, the ion concentration (Ca2+, PO43-, Mg2+) in the cell medium was analyzed by induced coupled plasma mass spectroscopy.

Results and Discussion:

The SF β-sheet content increased by combining the SF solution with CPC and the inorganic setting product was an increasing fraction of monetite instead of brushite. SEM images showed cement crystals homogeneously embedded in the SF matrix. While the CPC references showed a brittle character, the CPC/SF composites do not entirely fail under compression or bending load. The cell activity and proliferation increased with a higher SF content over 14 d. The materials released PO43- and adsorbed Ca2+ and Mg2+ from the medium, whereas ion adsorption / release was continuously decreasing with an increasing SF content in the composite.

The low pH during the setting reaction initiates SF-gelation, whereas the cement setting starts by the provided water in the SF solution. Thereby, two reactions run simultaneously catalyzing each other to build up two interpenetrating matrices. The so produced composite shows improved mechanical and biological properties.

References:

1. Tamini F. et al., Acta Biomater, 8(2):474-87, 2012

2. Cama G. et al., J Mater Chem B, 1(7):958-69, 2013

3. Vepari Ch. & Kaplan D. L., Prog. Polym. Sci., 32: 991-1007, 2007

V22

Improvement of Biomedical Silicone by the Use of Nanoporous Silica Nanoparticles

*T. Heemeier1, K. Besecke1, S. Noyun1, L. Doniga-Crivat2, S. Besdo2, P. Behrens3,1

1Leibniz Universität Hannover, Cluster of Excellence Hearing4all, Institut für Anorganische Chemie , Hannover, Deutschland

2Leibniz Universität Hannover, Institut für Kontinuumsmechanik, Hannover, Deutschland

3Leibniz Universität Hannover, Institut für Anorganische Chemie, Hannover, Deutschland

Introduction:

Silicones are known to be biocompatible and bioinert and therefore applicable in various medical areas.[1] In our study we aim to use nanoporous silica nanoparticles (NPSNPs) as filler material instead of typically used fumed silica. The porous nanoparticles could act as a delivery system for drugs and growth factors in order to improve the biointegration of the silicone implant. The focus of this work was the functionalization of NPSNPs with trimethyl- and vinyldimethylchlorosilane to make them compatible with the silicone matrix. Afterwards, these NPSNPs were incorporated into a silicone to achieve reinforcing effects on the silicone network. Different concentrations of these modified NPSNPs should lead to different mechanical properties comparable to the effect of fumed silica.[2]

These silicones could be applied to improve the application in different fields of otology dealing with the restoring of hearing. For example, an ear-drum pad based on silicone as interponate for an optimized middle-ear prosthesis is being developed and also the silicone coating of the cochlear electrode of a cochlear implant shall be improved.

Materials and Methods:

NPSNPs were synthesized from alkaline aqueous solution containing tetraethylorthosilicate and cetyltrimethylammonium bromide.[3] The used silicone was a 2-component silicone (Silpuran® 2430, Wacker Chemie AG, Germany) which is certified as biocompatible. To obtain NPSNPs which are compatible with the used silicone matrix they were functionalized with trimethyl- and vinyldimethylchlorosilane. For incorporation of the NPSNPs into the polymer matrix, the uncured silicone was mixed with various contents of the NPSNPs in a SpeedMixer™ using an optimized mixing procedure. Subsequently, the samples were cured at 120 °C.

Results and Discussion:

The incorporation of functionalized NPSNPs was successful and transmission electron microscopy indicates a homogenous distribution of the particles and a formation of a silica network. Samples were characterized by rheological investigations and cyclic tensile tests. Both mechanical tests showed a positive reinforcing effect of the nanoparticles on the network which increases with increasing nanoparticle content. The storage modulus could be doubled indicating an improve of rigidity. The stress and hystereses measured with cyclic tensile tests also increased leading to the typical result for filler-containing rubber-like materials.[2]

Within our study we showed that NPSNPs improve the mechanical properties of silicones, thus they could be a promising alternative to fumed silica applied as filler in silicones.

Acknowledgement:

This work was supported by the Cluster of Excellence Hearing4all and by the DFG within the Collaborative Research Program SFB 599.

References:

[1] K. J. Quinn, J. M. Courtney, Br. Polym. J. 1988, 20, 25-32.

[2] B. B. Boonstra, H. Cochrane, E. M. Dannenberg, Rubber Chem. Technol. 1975, 48,558-76.

[3] Z. A. Qiao, L. Zhang, M. Guo, Y. Liu, Q. Huo, Chem. Mater. 2009,21, 3823-3829.

V23

Development and characterization of hydrogel-calcium phosphate composite materials for mechanobiological study

*K. S. Sen1, D. F. Duarte Campos1, A. Blaeser1, J. Abert1, M. Köpf1, H. Fischer1

1RWTH Aachen university hospital, Dental Materials and Biomaterials Research, Aachen, Deutschland

Introduction:

The mechanical effects of substrates such as stiffness have significant influence on the biological cell response and exhibit guidance to multipotent differentiation of cells towards a specific fate (durotaxis) as shown in various previous studies. By combining different hydrogels with calcium phosphate particles, we will investigate the impact of substrate elasticity on a broad range covering both soft and rigid scaffolds using a composite material with tuneable elastic properties. The mechanobiological aspects of 3D scaffolds, up to now, have not been sufficiently addressed and studied.

Materials and Methods:

Tricalciumphosphate (β-TCP, Ca3(PO4)2) particles, which are osteoconductive, are incorporated into different hydrogels (agarose, alginate, collagen, and combination thereof) at various concentrations. To this end, the composite materials are characterized as follows: 1) phase and size of calcium phosphate particles, 2) distribution of the ceramic particles in the cross-linked samples, 3) elasticity of the composites, 4) viscosity, surface tension and gelation time of the non-crosslinked composite materials, and 5) swelling and degradation of the composites. Calcium phosphate particles at a concentration of 0.5 mg/ml and 5 mg/ml were incorporated into agarose and agarose-collagen combination.

Results and Discussion:

At 0.2 strains, 2 % agarose with 0.5 mg/ml β-TCP exhibited a compressive tangent modulus of 105.4 kPa, whereas 2 % agarose with 5 mg/ml β-TCP had a compressive tangent modulus of 132.5 kPa measured by unconfined compression testing. Similarly, the stiffness and viscosity increased with increasing concentration of calcium phosphate in agarose-collagen blends. The cellular response of human mesenchymal stromal cells cultured on composite samples (2D) and embedded in composite materials (3D) with varying elasticity are studied with respect to morphology and proliferation behavior. Ultimately, the mechanobiological aspects will be addressed in the context of 3D scaffolds made of hydrogels, calcium phosphates, and combinations thereof.

V24

In-vitro-Untersuchungen verschiedener Kollagen-basierter Scaffolds für die Augmentation von Sehnendefekten

*C. Gabler1, J. Pasold1, T. Tischer1, R. Bader1

1Universitätsmedizin Rostock, Forschungslabor für Biomechanik und Implantattechnologie, Orthopädische Klinik und Poliklinik, Rostock, Deutschland

Einleitung:

Sehnenrupturen gehen häufig mit schwerwiegenden Funktionsverlusten einher, die oft eine operative Versorgung erfordern. Bislang kommerziell verfügbare Scaffolds zur Augmentation humaner Sehne zeigen unterschiedliche klinische Ergebnisse. In dieser in-vitro Studie wurde ein neu entwickelter biologischer Scaffold auf Kollagen-Basis biomechanisch und zellbiologisch untersucht. Dieser Scaffold, chemisch vernetzt, mit ausgerichteter Faserstruktur und basierend auf bovinem Kollagen, wurde mit einem kommerziell verfügbaren Scaffold, basierend auf porciner dermaler extrazellulärer Matrix (Arthrex® DX Reinforcement) verglichen.

Materialien und Methoden:

Biomechanische Untersuchungen wurden an insgesamt 40 definierten Scaffold-Proben durchgeführt. Diese wurden davor in NaCl-Lsg. über verschiedene Zeiträume (30 min, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d) bei Raumtemperatur (RT) und 37 °C hydriert. Als Kontrolle dienten drei Proben des DX Reinforcement Materials (hydriert geliefert). Maximale Zugkraft (Fmax), Reißfestigkeit (Rm) und Steifigkeit (S) und E-Modul (EM) wurden evaluiert. Für die zellbiologischen Untersuchungen wurden humane Fibroblasten auf beide Scaffolds ausgesät und für 7, 14 und 21 Tage kultiviert. Die Zellvitalität wurde mittels Lebend/Tot-Färbung am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Zusätzlich wurde die Stoffwechselaktivität via WST-1 Assay untersucht.

Ergebnisse und Diskussion:

Nach 30 min Hydrierung bei RT zeigten die neu entwickelten Scaffold-Proben signifikant höhere (p ≤ 0.05) biomechanische Kennwerte (Fmax = 362 N; E-Modul = 87 MPa) im Vergleich zum DX Reinforcement Material (Fmax = 216 N; E-Modul = 17 MPa). Die biomechanischen Eigenschaften der Proben blieben über die Dauer der Hydrierung annähernd konstant. Die Hydrierung bei 37 °C resultierte in einem leichten Abfall der Werte im Vergleich zur Hydrierung bei Raumtemperatur. Für das Probenmaterial konnte eine dichte Zellbesiedelung und hohe Zellvitalität sowie eine gute Stoffwechselaktivität über die gesamte Kultivierungsdauer, vergleichbar mit dem DX Reinforcement Material, aufgezeigt werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass der neu entwickelte bovine Scaffold gute biomechanische und zellbiologische Eigenschaften aufweist. In nachfolgenden tierexperimentellen Untersuchungen müssen diese positiven Eigenschaften für die Sehnenregenration bestätigt werden.

V25

How the Interfacial Shear Strength in PLGA Fibre-Reinforced Brushite Cements Affects the Composites Mechanical Properties

*S. Maenz1, M. Hennig1, M. Mühlstädt1, E. Kunisch2, R. W. Kinne2, J. Bossert1, K. D. Jandt1

1Lehrstuhl für Materialwissenschaft, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Jena, Deutschland

2Arbeitsgruppe für experimentelle Rheumatologie, Universitätsklinikum Jena, Waldkrankenhaus “Rudolf Elle” , Eisenberg, Deutschland

Introduction:

Injectable calcium phosphate cements (CPCs) are promising materials for the minimal invasive treatment of bone defects. Unfortunately, currently available CPCs have small mechanical strength and fracture toughness, respectively. One approach to overcome these limitations is the modification of the CPC with reinforcing fibres. The results of a previous study suggest that the interfacial shear strength between matrix and reinforcing poly(l-lactide-co-glycolide) (PLGA) fibres and, therefore, the critical fibre length is of importance for the reinforcing efficiency.

Therefore, the aim of this current study is to control the interfacial shear strength by modifications of the reinforcing fibres and to analyse the impact of the interfacial shear strength on the bulk mechanical properties of fibre-reinforced CPCs.

Materials and Methods:

PLGA fibres with a diameter of 350 μm were treated with oxygen plasma (100 W - 300 W, 1 min - 10 min). The modified fibres were then embedded into cylinders of a brushite-forming CPC. The interfacial shear strength between PLGA and CPC matrix was tested in a single-fibre pull-out test. The fibre surfaces were characterized by scanning electron microscopy (SEM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and water contact angle measurements.

To analyse the impact of the interfacial strength on the bulk mechanical properties of fibre-reinforced CPCs, PLGA fibres with a diameter of 25 μm and a length of 1 mm were surface treated as described above and incorporated into a brushite-forming CPC. The bulk mechanical properties were determined in a 3-point flexural test.

Results and Discussion:

The interfacial shear strength between the oxygen plasma treated PLGA fibres and the CPC matrix increased statistically significantly compared to untreated PLGA fibres by up to 100%. The increase in the interfacial shear strength was found to be proportional to the ratio between oxygen and carbon at the fibre surface measured by XPS.

For the bulk mechanical properties of the fibre-reinforced CPC, we observed only a slightly increase in the flexural strength due to the increased interfacial shear strength. In addition, the increased interfacial shear strength changed the fracture behaviour from a quasi-brittle failure to a more ductile failure. This was quantified by the strain at which the stress declined to half of the flexural strength.

The present study demonstrates the possibility to improve the mechanical properties of fibre-reinforced CPCs by surface modifications of the reinforcing fibres. Oxygen plasma treatment resulted in increased interfacial shear strength between PLGA fibres and CPC and, thus, in improved mechanical properties of the composite.

V26

Mikrostrukturierte bioaktive Gläser zur gezielten Beeinflussung des Adhäsionsverhaltens knochenbildender Zellen

*M. Höner1, B. Pföss2, M. Wirth3, T. Vossel3, A. Bührig-Polaczek3, R. Conradt2, H. Fischer1

1RWTH Uniklinik Aachen, Zahnärztliche Werkstoffkunde und Biomaterialforschung, Aachen, Deutschland

2RWTH Aachen, Institut für Gesteinshüttenkunde, Aachen, Deutschland

3RWTH Aachen, Gießereiinstitut, Aachen, Deutschland

Einleitung:

Bioaktive Gläser sind etablierte Knochenersatz- und Zahnbeschichtungswerkstoffe. Sie sind zytokompatibel, bioaktiv, binden in vivo schnell an Hart- und Weichgewebe und können je nach Zusammensetzung vom Körper abgebaut werden. Da bekannt ist, dass eine gezielte Oberflächenstrukturierung die Zelladhäsion und -differenzierung von Vorläuferzellen beeinflussen kann, wurden in einem von der DFG finanzierten Vorhaben Bioglasoberflächen mittels Präzisionsgussverfahren mikrostrukturiert. Die daraus resultierende In-Vitro-Bioaktivität und die Reaktionen von Zellen auf die mikrostrukturierten Bioglasoberflächen wurden im Detail untersucht.

Materialien und Methoden:

Biogläser unterschiedlicher Zusammensetzungen wurden erschmolzen und mittels Schwerkraftguss in mikrostrukturierte Formen gegossen. Die Qualität der erhaltenen Oberflächen-Mikrotopographien auf den Bioglasproben wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie und 3DLaserscanmikroskopie charakterisiert. Zur Untersuchung der Bioaktivität in vitro wurden Experimente in stehendem und kontrolliert fließendem Simulated Body Fluid durchgeführt. Ein Reaktor, der es ermöglicht, Strömungen in der Größenordnung von Körperflüssigkeiten zu simulieren, wurde eigens hierzu entwickelt. Die Charakterisierung der eingelagerten Proben erfolgte mittels XRD, REM und EDX. Weiterhin wurden Versuche mit osteoblastenähnlichen Zellen (MG-63) und humanen mesenchymalen Stammzellen durchgeführt. Nach Kultivierung wurden die Zellvitalität, die Proliferation und die Morphologie der Zellen untersucht.

Ergebnisse und Diskussion

Es ist erstmalig gelungen, bioaktive Gläser gezielt im direkten Guss zu mikrostrukturieren. Dadurch wurde es möglich, den Einfluss definierter Oberflächen-Mikrotopographien auf bioaktiven Gläsern systematisch zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Mikrostrukturen sowohl in stehendem Medium als auch unter aggressiveren Bedingungen in bewegtem Medium bis zu 14 Tagen bestehen bleiben und sich eine calciumphosphatreiche sowie eine siliziumdioxidreiche Schicht ausbilden. Die Zellkulturergebnisse belegen eine hohe Zellviabilität (weit über 95 %) und Aktivität. Die Zellen spreizen sich aus und ordnen sich in Richtung der Strukturen an. Dieser Effekt könnte zukünftig zu einer gezielten Beeinflussung des Adhäsionsverhaltens von knochenbildenden Zellen an Bioglas-Knochenimplantaten genutzt werden.

V27

Alginat-Hydrogele, beschichtet mit Calciumphosphat-Nanopartikeln durch elektrophoretische Abscheidung

*S. Berger1, K. Wallat1, M. Gepp2, R. Le Harzic2, F. Stracke2, H. Zimmermann2,3, M. Epple1

1Universität Duisburg-Essen, Institut für Anorganische Chemie und Center for Nanointegration Duisburg-Essen (CeNIDE), Essen, Deutschland

2Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT, St. Ingbert, Deutschland

3Universität des Saarlandes, Institut für Molekulare und Zelluläre Biotechnologie, Saarbrücken, Deutschland

Einleitung:

Die elektrophoretische Abscheidung (electrophoretic deposition, EPD) wird genutzt, um Oberflächen (z.B. Implantate) mit (Nano-)Partikeln zu beschichten und so ihre Bioaktivität zu erhöhen.[1, 2] Die Partikel können für den Transport von z.B. Nukleinsäuren genutzt werden, da sie ohne weitere Transportsysteme leicht von Zellen aufgenommen werden können.[3] Alginat ist ein biomedizinsch häufig eingesetztes Hydrogel.[4, 5]

Materialien und Methoden:

Für die EPD wurden drei verschiedene Calciumphosphat-Nanopartikel genutzt, welche mit Polyethylenimin (PEI) stabilisiert wurden. Diese können mit fluoreszierenden Molekülen (z.B. PEI mit Tetramethylrhodamin, PEI-TRITC) sowie mit Biomolekülen funktionalisiert werden.

Die Partikel werden in Ethanol oder H2O dispergiert, wobei der Unterschied in der für die EPD angelegte Spannung liegt (Tab. 1).

Abbildung 1

Tab. 1

Parameter der EPD von Calciumphosphat-Nanopartikeln auf Silicium.

DispersionsmittelEthanolH2O
Spannung50 V2 V
Abscheidezeit0.5 – 2 min30 – 300 min

Die Alginat-Beads wurden wie in Refs.[4, 6] beschrieben hergestellt. Die Beads wurden mit Nanopartikeln beschichtet, indem diese über die Nanopartikel-beschichtete Silicium-Oberfläche gerollt wurden.

Ergebnisse und Diskussion:

Abb. 1 zeigt ein typisches Ergebnis einer mit Calciumphosphat-Nanostäbchen elektrophoretisch beschichteten Silicium-Oberfläche. Abb. 2 zeigt ein Alginat-Bead, das mit rot fluoreszierenden Nanopartikeln beschichtet wurde. Die Übertragung der Nanopartikel war sehr effizient, was durch die hohe Fluoreszenz-Intensität deutlich wird. Zur Überprüfung der veränderten Oberflächeneigenschaften des Alginats durch die Nanopartikel wurde die Adhäsion von Fibroblasten nach 24 h quantifiziert. 76±21% der Zellen adhärierten an die Nanopartikel-beladenen Beads, aber nur 1.8±2.2% an die Oberfläche der reinen Hydrogele. Die Affinität der Fibroblasten zu den beschichteten Alginat-Beads ist somit deutlich höher als zu den reinen Alginat-Hydrogelen.

Referenzen:

[1] V. Sokolova et al., Angew. Chem. Int. Ed.2008, 47, 1382-1395.

[2] A. Kovtun et al., J. Phys. Chem. B2013, 117, 1550-1555.

[3] A. R. Boccaccini et al., J. R. Soc. Interface2010, 7, 581-613.

[4] H. Zimmermann et al., Curr. Diab. Rep.2007, 7, 314.

[5] K. Wallat et al., in Optically Induced Nanostructures. Biomedical and Technical Applications (Eds.: K. König, A. Ostendorf), de Gruyter, Berlin, 2015, 217-238.

[6] H. Zimmermann et al., Appl. Phys. A. 2007, 89, 909-922.

Danksagung

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1327) unterstützt.

Abbildung 1

Abbildung 1

Abbildung 2

Abbildung 2

V28

Improvement of Neural Electrodes by Nanoporous Platinum Coatings

*K. D. Kreisköther1, D. Warwas1, D. Müller1, N. Ehlert1, J. Schulze2, K. Kranz2, K. Wissel2, A. Warnecke2, P. Behrens1

1Leibniz Universität Hannover, Institut für Anorganische Chemie, Hannover, Deutschland

2Hannover Medical School, Departement of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Hannover, Deutschland

Introduction:

The aim of this work is to improve the function of the cochlear electrode by enhancing the long-term biointegration and the contact between cochlear electrode and nerve fibers. This can be realized by chemical modification of the electrode surface or by integrating a drug delivery system [1] in e.g. nanoporous platinum coatings. For loading the pores with different drugs, the pore diameter has to be adjusted. This can be achieved by the use of different methods for the deposition of platinum. In addition, the impedance can be reduced due to the increased surface of the platinum coatings [2].

Materials and Methods:

Nanoporous platinum is deposited electrochemically on metal surfaces using different templates. Within the first method, the surfactant Pluronic® F127 is dissolved in aqueous Pt4+ solution. During the electrochemical deposition of platinum, Pluronic® F127 is included in the platinum coating and removed subsequently during calcination at 350 °C. Within the second method, metal surfaces are coated initially with an aqueous dispersion of polystyrene latex beads. After template formation, the platinum is deposited electrochemically in the voids of the polystyrene latex beads layer. Subsequently, the polystyrene latex beads are dissolved by storing in toluene.

The coatings were characterized by scanning electron microscopy, atomic force microscopy, confocal microscopy, sorption measurements, impedance measurements, and cell culture tests with NIH3T3 fibroblasts as well as spiral ganglion cells.

Results and Discussion:

Both methods lead to coatings containing nanopores. By using Pluronic® F127 pores with a size of about 10 nm are obtained, applicable for smaller drugs like rolipram. By using polystyrene latex beads the average pore diameter is increased to 50 nm, corresponding to the size of the beads (Figure 1). These pores can be loaded with larger drugs like the growth factor BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Impedance measurements of the nanoporous platinum coatings show improved impedance in the lower frequency range. Cell culture investigations with NIH3T3 fibroblasts and spiral ganglion cells indicate a good cell compatibility (Figure 2).

Acknowledgement:

This work was supported by the DFG within the Cluster of Excellence Hearing4all.

References:

[1]. Ehlert, N. et al., Chem. Soc. Rev. 42:3847-3861, 2013

[2]. Schlie-Wolter, S. et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 5:1070-1077, 2013

Figure 1

Figure 1

Figure 2

Figure 2

V29

Thermal spraying of calcium phosphate coatings with bactericidal properties

*P. Krieg1, A. Killinger1, R. Gadow1, A. Bernstein2

1Universität Stuttgart, Stuttgart, Deutschland

2Universitätsklinikum Freiburg, Freiburg, Deutschland

Introduction:

Degradable calcium phosphate coatings offer a faster osseointegration of endoprosthetic implant devices in the body and can be manufactured through various processing technologies, such as thermal spraying. Among the thermal spraying techniques, a novel way to produce calcium phosphate bioactive coatings is the High Velocity Suspension Flame Spraying (HVSFS).A common problem that occurs after the implantation is the risk of an inflammation in the body which can result in the need of a second operation or even the removal of the implant. In a novel approach, metal ions with antibacterial properties such as silver (Ag) or copper (Cu) can be incorporated in the suspension flame sprayed coatings to reduce the risk of inflammation.

Materials and Methods:

Suspensions containing calcium phosphates (hydroxyapatite, TCP, GB14) were produced. These suspensions were modified in order to incorporate metal ions with antibacterial properties in the final coatings. The suspensions were characterized regarding their particle size and zeta potential.

The coatings were charcterized regarding their microstructure and thickness. The surface of the coatings was characterized by white light interferometry as well as scanning electron microscope (SEM). The phase composition was investigated via XRD and Raman spectroscopy. Cell toxicity was characterized by Live/Dead assay.

Results and Discussion:

Thin (~20 μm) and dense calcium phosphate coatings were succesfully sprayed. Metals as well as metal oxides can be found in the coatings. The coatings show no cell toxicity.

V30

Mikrostrukturierte Hydrogele für die Herstellung von multizellulären Sphäroiden

*P. Lund1, C. Aldrian1, N. Melin2, Y. Thomann3, R. Thomann3, U. Nestle1, N. Nanko1, A. Heselich4, A. R. Thomsen1

1Universitätsklinikum Freiburg, Klinik für Strahlenheilkunde, Freiburg, Deutschland

2University of Bern, Visceral and Transplantation Surgery, Bern, Schweiz

3Universität Freiburg, Freiburger Materialforschungszentrum, Freiburg, Deutschland

4GSI Helmholtz Center for Heavy Ion Research, Department for Biophysics, Darmstadt, Deutschland

Einleitung:

Die 3-dimensionale Zellkultur in Form multizellulärer Sphäroide ist in der Forschung und Industrie von wachsender Bedeutung. Anwendungsgebiete sind unter anderem toxikologische und strahlenbiologische Untersuchungen. Außerdem haben sich in vitro hergestellte Sphäroide für die Therapie von Gelenkknorpeldefekten bewährt und eignen sich als Bausteine für die Konstruktion komplexer Gewebe. Die bisher etablierten 3D-Zellkultur-Verfahren weisen jedoch einige Nachteile auf. Sie sind für die Herstellung mehrerer tausend homogener Sphäroide nur eingeschränkt geeignet. Denn entweder ist wie bei den liquid overlay- und hanging drop-Techniken, bei denen pro Zellkultur-Kompartiment nur ein Sphäroid entsteht, der Material- und Arbeitsaufwand sehr hoch oder die Größenverteilung der Zellaggregate ist wie bei der spinner flask-Technik zu heterogen.

Hydrogele aus Agarose, die auch bei der liquid overlay-Technik eingesetzt werden, sind für die Zellen unschädlich und verhindern deren Adhäsion. Damit bieten sie optimale Eigenschaftenzur Erzeugung vitaler und homogener Sphäroide.

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung mikostrukturierter Agarose-Gele mit einer Vielzahl von konischen Vertiefungen, um die effiziente Herstellung von gleichförmigen Sphäroiden aus einer Zellsuspension zu ermöglichen.

Materialien und Methoden:

Mit einer CNC-Fräsmaschine wurden Arrays aus konischen Vertiefungen in Poly(methylmethacrylat) (PMMA) oder Polyoxymethylen (POM) gefräst und mit einem additionsvernetzenden Silikon abgeformt. Die Perioden der Vertiefungen betrugen 2 mm, 1 mm und 0,5 mm.

Die Original-Arrays und die Silikonabformungen wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht.

Zu Herstellung der mikrostrukturierten Agarose-Gele wurden die Silikonformen mit flüssiger Agarose ausgegossen und zentrifugiert. Nach Abkühlen und Erstarren wurden die Agarose-Gele ausgeformt und lichtmikroskopisch vermessen.

Humane mesenchymale Stromazellen (hMSC) und verschiedene Tumorzelllinien (HT-29, T47D, MTPa) wurden als Zellsuspensionen in die Agarosestrukturen eingesät, so dass im Mittel 200 - 10.000 Zellen pro Vertiefung zu liegen kamen. Nach Aggregation der Zellen wurde die Größenverteilung der Sphäroide mittels elektronischer Bildanalyse untersucht.

Ergänzend wurde die Vitalität der die Sphäroide konstituierenden Zellen in den Agarosematrices mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht.

Ergebnisse und Diskussion:

Durch die Abformtechnik entstanden Replikate, die alle Details der Originalarrays wiedergaben (Fig. 1: Rasterelektronenmikroskopien von Original, Periode 1 mm (links) und korresponierender Silikonabformung (rechts)). Pro cm² entstanden 25, 100 bzw. 400 konische Vertiefungen. Die Abweichung der Agarosestrukturen vom Original betrug < 1%.

Nach Zugabe einer Zellsuspension auf das flächendeckende Raster aus konischen Vertiefungen sedimentierten die Zellen gleichmäßig bis auf den Boden und fügten sich zu multizellulären Aggregaten zusammen. Die Größenverteilung der Sphäroide ergab eine Standardabweichung < 16 % des Durchmessers.

Während der mehrwöchigen Kultivierung nahm die Größe der Sphäroide kontinuierlich zu, wobei der Anteil vitaler Zellen stetig hoch war. Unabhängig von der Größe ließen sich die Sphäroide durch Wenden der Agarose-Struktur und kurze Zentrifugation ohne Verluste ernten.

Die vorgestellte Methodik erlaubt die Herstellung, Kultivierung und Ernte von großen Zahlen an gleichförmigen Zellaggregaten mit geringen Kosten und technischem Aufwand und stellt daher eine interessante Ergänzung zu den etablierten 3D-Zellkulturmethoden dar.

Abbildung 1

Abbildung 1

V31

Biokompatibilität keramischen Faserverbundwerkstoffen für den Einsatz als Gleitpartner in der Endoprothetik

*A. Reichert1, R. Gadow2, H. O. Mayr1, N. P. Südkamp1, P. Weichand1, A. Bernstein1

1Universitätsklinikum Freiburg, Department Orthopädie und Traumatologie, Freiburg, Deutschland

2Universität Stuttgart, Institut für Fertigungstechnologie keramischer Bauteile (IFKB), Stuttgart, Deutschland

Ziel:

Das Standardverfahren zur Behandlung degenerativ, entzündlich oder anderweitig geschädigter Gelenke ist der künstliche Gelenkersatz mit Hilfe von Endoprothesen. In Forschungsprojekten wird versucht, die Tribologie der bisher angewandten Gleitpaarungen zu verbessern. Der Einsatz von C/SiC Verbundkeramiken ist eine vielversprechende Möglichkeit dies zu verwirklichen. C/SiC Keramiken zeigen eine hohe mechanischer Resistenz, tribologisch günstige mechanischen Eigenschaften und eine hohe Verschleißfestigkeit. Das Ziel des Projektes ist die Prüfung der Biokompatibilität von keramischen Faserverbundwerkstoffen für den Einsatz als Gleitpartner in der Endoprothetik.

Material und Methode:

Es wurden die Biokompatibilitäten einer C/SiC Keramik und von Nanopartikel dieser Keramik (60, 100 und 300 nm, Abriebsimulation) in den Konzentrationen 0,01 μg/ml, 1 μg/ml, und 10 μg/ml untersucht. Das In-vitro-Verhalten wurde mittels den Zellkulturlinien MG63 und THP-1 und humanen Osteoblasten getestet. Eine mögliche Aufnahme der Partikel in die Zellen, die Zellzahl und Veränderungen der Morphologie wurde mittels Lichtmikroskopie (Giemsa Färbung), ESEM und Laserscanningmikroskopie analysiert. Folgende biochemischen Tests wurden durchgeführt: WST, LDH, BCA, AP, Live/Dead Assay. Zusätzlich wurden immunhistochemisch und mittels Western Blot Kollagen Typ I, AP, RANK und GABDH zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Statistische Analyse: T-Test, Mann-Whitney-U-Test, Wilcoxon-Test mit statistischer Signifikanz p<0.05.

Ergebnisse:

Die Formkörper zeigen eine gute Biokompatibilität. Die Nanopartikel werden von den Zellen aufgenommen. Die Proliferation der Zellen wird durch die Partikel nichtverändert. Morphologie bleibt unverändert. Es kommt zu keiner Erhöhung der LDH Aktivität. Die Konzentration 10 μg/ml führt zu einer Reduktion der Zellzahlen.

Schlussfolgerungen:

C/SiC Verbundkeramiken und deren Abriebpartikel zeigen eine gute Biokompatibilität. Diese Hochleistungskeramiken stellen eine vielversprechende Möglichkeit zur Verbesserung Gleitpaarung in der Endoprothetik dar.

V32

Zellbeladene Hydrogel-Blends aus Agarose und Kollagen I als geeignete Biotinten für Druckprozesse und Zellkultur in 3D

*M. Köpf1, D. F. Duarte Campos1, A. Blaeser1, K. Sen1, H. Fischer1

1Universitätsklinikum RWTH Aachen, Zahnärztliche Werkstoffkunde und Biomaterialforschung (ZWBF), Aachen, Deutschland

Einleitung:

Die Anwendung der Additiven Fertigungstechnik auf das Forschungsgebiet des Tissue Engineerings erfordert die Erforschung von Materialien, die sowohl biologischen als auch technischen Anforderungen genügen. Die nachfolgende Studie fußt auf der Arbeitshypothese, dass Blends aus den Hydrogelen Agarose und Kollagen eingebetteten Zellen das Spreizen und Proliferieren ermöglichen und gleichzeitig dreidimensional druckbar sind.

Materialien und Methoden:

Für die 3D-Kultur wurden Agarose, Kollagen I und hASMCs gleichmäßig vermischt, in Wells gegossen und nach Zugabe von Medium inkubiert. Bei konstanter Kollagenkonzentration von 0,2 % variierte der Agarosegehalt im Blend zwischen 0,5 und 1,0 %. Nach Ablauf einer Kultivierung von 5-7 Tagen erfolgte die Bildgebung durch FDA-Färbung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die in den unterschiedlichen Hydrogelen auftretende Zellmorphologie wurde ausgewertet. Weiterhin wurde neben dem Schwell- und Degradationsverhalten die Proliferation der Zellen in den genannten Gelen gemessen. Der 3D-Druck der Hydrogel-Zell-Suspensionen erfolgte im Drop-On-Demand-Printing-Verfahren durch Mikroventile mit Durchmessern zwischen 150 und 600 μm bei Drücken zwischen 0,5 und 1,0 bar. Untersucht wurde neben der Genauigkeit des Druckverfahrens die Zellviabilität unmittelbar nach dem Druckvorgang (FDA-, PI-Färbung).

Ergebnisse und Diskussion:

Sämtliche Hydrogel-Blends waren durch das genannte System unter Einhaltung hoher Zellviabilität dispensierbar. Weiterhin gelang der Aufbau einfacher, dreidimensionaler Strukturen. Es wurde ein gegenläufiger Zusammenhang zwischen der Anzahl an gespreizten Zellen und der Agarosekonzentration beobachtet. Bei einer Agarosekonzentration von 1,0 % blieben die Zellen über den gesamten Zeitraum der Kultur abgerundet. Gleichzeitig ermöglichte aber der höchste Agarosegehalt die höchste Auflösung im Druckprozess. Während der Degradation wurden keine zellunverträglichen Schwankungen des pH-Wertes gemessen.

Die Ergebnisse deuten auf ein schmales Prozessfenster hin, in dem dimensionsstabile 3D-Konstrukte hergestellt werden können, die gleichzeitig günstige Bedingungen für eine Angiogenese bieten. Nachfolgend wird in Langzeitversuchen das Exprimieren von Matrixproteinen näher untersucht.

Published Online: 2015-10-5
Published in Print: 2015-10-1

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