Biokompatibilität I: in vivo und in vitro

De Gruyter | Published online: October 5, 2015

V39

Minimal-invasive Operationsmethode für die lumbale, ventrolaterale Vertebroplastie im Großtiermodell Schaf zur in-vivo-Testung bioaktiver Zemente

*M. Bungartz1, S. Maenz2, E. Kunisch3, V. Kopsch3, X. Long3, J. Mika1, J. Adolph3, S. Bischoff4, H. Schubert4, A. Sachse1, B. Illerhaus5, J. Günster5, J. Bossert2, K. D. Jandt2, R. W. Kinne3, O. Brinkmann1

1Universitätsklinikum Jena, Waldkrankenhaus “Rudolf Elle”, Lehrstuhl für Orthopädie, Eisenberg, Deutschland

2Otto Schott Institut für Materialforschung, Friedrich-Schiller-Universität, Lehrstuhl für Materialwissenschaft, Jena, Deutschland

3Universitätsklinikum Jena, Waldkrankenhaus “Rudolf Elle”, AG Experimentelle Rheumatologie Unit, Lehrstuhl fuer Orthopädie, Eisenberg, Deutschland

4Universitätsklinikum Jena, Institut für Versuchstierkunde und Tierschutz, Jena, Deutschland

5BAM Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung (BAM), Berlin, Deutschland

Einleitung:

Zur Vermeidung der Nachteile von bioinerten Polymethylmethacrylat-Zementen bei der Vertebro-/Kyphoplastie von osteoporotischen Wirbelkörperfrakturen wird momentan intensiv an der Entwicklung von injizierbaren, resorbierbaren und bioaktiven Calcium-Phosphat Zementen (CPC) gearbeitet. Aufgrund des Mangels von Großtiermodellen für die präklinische Testung dieser Zemente diente die vorliegende Studie der Etablierung/Beschreibung eines strikt minimal-invasiven, ventrolateralen in vivo Vertebroplastie Modells an der Lendenwirbelsäule von Schafen.

Materialien und Methoden:

Definierte Knochendefekte (Durchmesser 5 mm; Tiefe ca. 70% der Gesamtwirbelkörperbreite) wurden über einen ventrolateralen, percutanen Zugang in den Lendenwirbelkörpern (L1: unbehandelte Kontrolle, L2: Leerdefekt, L3: CPC) von alten, osteopenischen, weiblichen Schafen geschaffen (40 Merino-Langwoll Schafe; 6 bis 9 Jahre, 68 bis 110 kg Körpergewicht; 3 und 9 Monate Standzeit). Trauma/Beeinträchtigung, Operationstechnik, Reproduzierbarkeit, resultierende Defekttiefe und Zementfüllung sowie funktionelle Verstärkung durch den Zement wurden mittels Messung der Operationsdauer und radiologischer Analysen, post-operativer Beeinträchtigung-Scores sowie ex vivo mittels Osteodensitometrie, mikro-CT, Histologie und biomechanischer Testung dokumentiert.

Ergebnisse und Diskussion:

Die minimal-invasive Vertebroplastie war kurz (durchschnittlich < 30 min) mit niedriger Röntgenzeit (< 1.6 min) und sehr begrenztem lokalen Zugangstrauma. Die Tiere zeigten eine schnelle post-operative Erholung und einen raschen Abfall des post-operativen Beeinträchtigungs-Scores auf 0. Die Reproduzierbarkeit der Defekttiefe (L2: 13.3 ± 0.5 mm; L3: 12.5 ± 0.5 mm) und Zementfüllung (126 ± 12 μl) wurde mittels intraoperativem Röntgen und ex vivo mittels konventionellem CT bzw. μCT dokumentiert. Die Osteokonduktivität und die funktionelle Verstärkung durch den CPC wurde mittels Osteodensitometrie (CPC > control; p ≤ 0.05; 3 und 9 Monate), μ T ( P > unbehandelte Kontrolle und Leerdefekt; p ≤ 0.05; 3 und 9 Monate) und Druckfestigkeitsmessungen bestätigt (CPC numerisch erhöht im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle; 1.02-fach bei 3 Monaten und 1.1-fach bei 9 Monaten).

Das etablierte, minimal-invasive Schafsmodell für die lumbale ventrolaterale Vertebroplastie garantiert eine kurze Operationszeit und postoperative Erholung sowie eine hohe Reproduzierbarkeit. Daher ist es für Studien zur präklinischen Testung von neu entwickelten, resorbierbaren und osteokonduktiven CPC sehr gut geeignet.

Abbildung 1

Abb. 1:  OP-Technik. (A) Linksseitige Positionierung unter Röntgen (lateral; a.p.); (B) Definition des Bohrkanal-Einganges (unteres 1/3 des Wirbelkörpers); finale Tiefe des Bohrkanals (contralaterale Begrenzung des processus spinosus; unteres Insert); (C) Einbringen eines Arbeitstrocars mit Stop über den Führungsdraht; (D) Einbringen des CPC mittels Applikations-System unter Röntgen; (E) Röntgen-Kontrolle der CPC Lage (intra-operativ; linkes oberes Insert bzw. konventionelles CT; rechtes oberes Insert und untere 3 Bilder); (F) OP-Feld nach Naht und Aluminium Spray.

Abb. 1:

OP-Technik. (A) Linksseitige Positionierung unter Röntgen (lateral; a.p.); (B) Definition des Bohrkanal-Einganges (unteres 1/3 des Wirbelkörpers); finale Tiefe des Bohrkanals (contralaterale Begrenzung des processus spinosus; unteres Insert); (C) Einbringen eines Arbeitstrocars mit Stop über den Führungsdraht; (D) Einbringen des CPC mittels Applikations-System unter Röntgen; (E) Röntgen-Kontrolle der CPC Lage (intra-operativ; linkes oberes Insert bzw. konventionelles CT; rechtes oberes Insert und untere 3 Bilder); (F) OP-Feld nach Naht und Aluminium Spray.

V40

Extrazelluläre Calciumionen und bioaktive Xerogele als Modulatoren der Connexin 43-basierten Osteogenese von Stromazellen

*A. Wagner1, T. Hanke2, B. Kruppke2, H. Worch2, S. Wenisch1

1Justus-Liebig-Universität Gießen, Klinikum Veterinärmedizin c/o Institut für Veterinäranatomie, -Histologie und -Embryologie, Gießen, Deutschland

2Technische Universität Dresden, Institut für Werkstoffwissenschaft, Max-Bergmann-Zentrum für Biomaterialien, Dresden, Deutschland

Einleitung:

Der Einfluss von bioaktiven Xerogelen und von Kultivierungsmedien, bestehend aus unterschiedlich hohen extrazellulären Calciumionenkonzentrationen, auf die osteogene Differenzierung von humanen aus Spongiosa isolierten mesenchymalen Stromazellen wurde unter Zellkulturbedingungen untersucht.

Materialien und Methoden:

Die Stromazellen wurden auf der Oberfläche der zwei neuartigen Xerogelen (B30 und B30W20) über 21 Tage kultiviert und osteogen differenziert. Bei den Xerogelen handelt es sich um bioaktive Werkstoffe, die in der Lage sind die Calciumionen-Konzentration in ihrer Umgebung abzusenken und Calcium-Phosphat-Präzipitate auf ihrer Oberfläche abzuscheiden*. Bei dem Werkstoff B30 handelt es sich um einen biphasischen Werkstoff bestehend aus 30 % bovinem Kollagen und 70% Silikat. Bei dem triphasischen Werkstoff B30W20 wurde der Silikatanteil auf 50% reduziert und zusätzlich eine Calcium-Phosphat Phase eingebracht, was eine deutliche Steigerung der Bioaktivität zur Folge hat.

Zur prinzipiellen Überprüfung der Sensitivität der Zellen gegenüber unterschiedlich hohen extrazellulären Calciumionenkonzentrationen in ihrer Mikroumgebung bis hin zum Fehlen von Calciumionen - zur Simulation der bioaktiven Kultivierungsbedingungen - wurden die Stromazellen über 21 Tage in entsprechenden Medien (0; 1.8; 10; 20 mmol l-1 ) kultiviert und ebenfalls osteogen differenziert.

Ergebnisse und Diskussion:

Die Untersuchungsergebnisse auf Ebene der Molekularbiologie (quantitative rtPCR) sowie die Ergebnisse des Life-Cell-Imaging, der Lucifer Yellow Farbstoff-Aufnahme und der von Kossa-Färbung zeigen, dass der extrazelluläre Calciumionen-Gehalt in der Umgebung der Zellen einen deutlichen Einfluss auf das Zellverhalten hat.

Eine geringere Bioaktivität als auch ein hoher Calciumionen-Gehalt in der Umgebung stimulieren neben Connexin 43 auch die Expression von Bone Sialoprotein. Außerdem steigern hohe extrazelluläre Calciumionenkonzentrationen die Funktionalität der Connexin 43-basierten Kanäle, die Zellmigration und die Mineralisierung der extrazellulären Matrix.

Die Ergebnisse erlauben die Schlussfolgerung, dass extrazelluläre Calciumionen die osteogene Differenzierung von Stromazellen über Aktivierung von Connexin 43-basierten Kanälen stimulieren.

Referenzen:

*Heinemann S, Heinemann C, Wenisch S, Alt V, Worch H, Hanke T., Acta Biomater. 2013 Jan;9(1):4878-88,2012

V41

Silver chloride nanoparticles exhibit higher antimicrobial activity than silver nanoparticles

*C. Sengstock1, K. Loza2, M. Epple2, T. A. Schildhauer1, M. Köller1

1Berufsgenossenschaftliches Universitätsklinikum Bergmannsheil, Chirurgische Universitätsklinik und Poliklinik, Chirurgische Forschung, Bochum, Deutschland

2University of Duisburg-Essen , Inorganic Chemistry and Center for Nanointegration Duisburg-Essen (CeNIDE), Essen, Deutschland

Introduction:

Silver nanoparticles (Ag-NP) have well-known antimicrobial activities against a broad spectrum of gram-negative and gram-positive bacteria. It is generally understood that Ag-NP oxidative conditions release silver ions (Ag+) and up to know free Ag+ are believed to act as the reactive silver species. Recently, we have shown that Ag+ released from Ag-NP into chloride-containing media (such as biological fluids) rapidly precipitated as poorly soluble silver chlorides. Now we prepared stable AgCl-NP and compared them with metallic Ag-NP at same silver content. The antibacterial activity towards Staphylococcus aureus (S. aureus) and Escherichia coli (E. coli) and the cell compatibility towards mammalian, i.e. human mesenchymal stem cells (hMSC) and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), were evaluated.

Materials and Methods:

Poly(N-vinylpyrrolidone) (PVP)-coated AgCl-NP and metallic Ag-NP were synthesized as described previously [1,2]. The minimal inhibitory concentration (MIC) for prokaryotic cells (S. aureus and E. coli) was determined in liquid culture medium, and the minimal bactericidal concentration (MBC) by plating the pre-incubated bacteria. The viability of the incubated leukocytes (PMBC) was determined by flow cytometry using 7-AAD. The viability and the morphology of the incubated hMSC were analyzed using calcein-AM staining.

Results and Discussion:

AgCl-NP have a higher toxicity towards eukaryotic cells and bacteria compared to metallic Ag-NP with a similar total silver dose. Antibacterial effects were observed for AgCl-NP at a concentration range of 2.0-5.0 μg mL-1 and for Ag-NP at a concentration range of 12.5-50 μg mL-1. AgCl-NP and metallic Ag-NP were easily taken up by eukaryotic cells. The cytotoxic effects towards hMSC and PBMC were observed for AgCl-NP at a concentration range of 2.5-5.0 μg mL-1 and for Ag-NP at a concentration of 25-50 μg mL-1. We found that these biological effects on eukaryotic and prokaryotic cells were dependent on protein content and cell number.

Our results demonstrate a crucial role of generated silver chloride particles on the biological effect of silver including the antibacterial activity. Currently, the mechanism of the cytotoxicity of dispersed AgCl-NP is further analyzed to check their possible use in antibacterial coatings.

References:

[1] Sengstock C, Diendorf J, Epple M, Schildhauer TA, Köller M. Beilstein J Nanotechnol 2014;5: 2058-2069.

[2] Loza K, Sengstock C, Chernousova S, Köller M, Epple M. RSC Adv 2014;4: 35290-35297.

V42

Magnesium from bio-resorbable implants: What can we learn on its distribution and impact on bone nano- and mineral structure by multi-modal synchrotron x-ray imaging?

*T. Grünewald1, H. Rennhofer1, B. Hesse2, M. Burghammer2, S. E. Stanzl-Tschegg1, M. Cotte2, J. Löffler3, A. M. Weinberg4, H. C. Lichtenegger1

1Universität für Bodenkultur, Institut für Physik und Materialwissenschaften, Wien,

terreich

2European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, Frankreich

3Swiss Federal Instutite of Technology Zurich, Laboratory of Metal Physics and Technology, Zurich, Schweiz

4Medizinische Universität Graz, Universitätsklinik für Orthopädie und orthopädische Chirurgie, Graz,

terreich

Introduction:

Biocompatibility is a key factor for the development of new implant materials. A novel class of biodegrading Mg implants exhibits promising properties in terms of inflammatory response and mechanical properties. The interaction between the Mg degradation products and the bone nano- and mineral structure is, however, not yet fully understood. Investigations by synchrotron microbeam x-ray fluorescence (μXRF), small angle x-ray scattering (μSAXS) and x-ray diffraction (μXRD) showed the impact of the degradation speed on the site of Mg accumulation in the bone, which is preferentially around blood vessels and the bone marrow. Only at highest degradation rates Mg could be identified at the implant interface.

The Mg inclusion into the bone matrix appears to be non-permanent as the level decreases after completed implant degradation. μSAXS andμ XRD show that the Mg influences the HAP (hydroxyl apatite) crystallite structure as in zones of high Mg concentration markedly thinner and shorter crystallites are found. Additionally these zones exhibit also a distortion of the HAP lattice. A comparison between XRD and SAXS derived mineral platelet thickness indicates a smaller relative crystallinity in zones of higher Mg concentration.

Materials and Methods:

The distribution of Mg and local bone structure of Sprague-Dawley rats following in-vivo degradation of two types of bioresorbable Mg alloys, WZ21 (slow) and ZX50 (fast), was investigated in this study. The ZX50 alloy contains 5% Zn and 0.25% Ca whereas WZ21 contains 1% Zn, 0.25% Ca, 0.15% Mn and 2%Y as alloying elements for Mg.

Bone is well-known to serve as a reservoir for biologically relevant trace elements. Here especially x-ray fluorescence (μXRF) and quantitative backscattered electron imaging (qBEI) helped to understand both the accumulation of trace elements in bone and the redistribution of minerals. In the present study μXRF measurements were used to determine the distribution of Mg at the bone-implant interface and in remote distance from it at micrometer and sub-micrometer spatial resolution. μXRF measurements were carried out at the at the micro-spectroscopy beamline, ID21, European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble.

Scattering techniques such as SAXS and XRD are particularly useful to probe the nanostructural properties of bone, as these methods allow to give averaged insight into a representative sample volume. Scattering methods prohibit the direct examination in real space; hence the data interpretation requires the use of models to extract meaningful information. Here, μSAXS and μXRD carried out at the microfocus endstation of ID13 at the ESRF, were used for the characterization of local bone nano-structure and mineralization in relation to local Mg content.

Results and Discussion:

It is shown that the Mg released during implant degradation is temporarily stored in the cortical bone matrix and released when the Mg level in the metabolic system is decreased (Fig 1). The walls of the blood vessel system as well as the bone marrow and the lacunae network are preferred sites of Mg accumulation (Fig 1a,b) while the bone-implant interface is only subject to Mg inclusion in cases of high degradation rates and consequently high metabolic Mg levels (Fig 1b). The study shows that once the implant degradation is completed, the accumulated Mg levels normalize (Fig 1c). It is furthermore demonstrated that Mg locally influences the bone nanostructure and mineralization. The platelet thickness of the bone mineral was found to be decreased in zones of high Mg concentrations (Fig 2b) and preferred orientation decreased (Fig 2f) . In the same zones the c-axis of the HAP crystal showed contraction (Fig 2e) and the crystallite size was decreased in longitudinal (Fig 2a) and transversal (Fig 2a) direction. By comparing the thickness of the mineral platelets as determined by SAXS with the crystallite size obtained from XRD, a locally decreased crystallinity could be attributed to zones of high Mg concentration (Fig 2c) which could possibly indicate the near-surface inclusion of Mg into the HAP structure, leading to a distorted lattice and hence reducing the coherence length of the crystal. Still other modes of Mg inclusion (newly formed mineral phases in response to high Mg levels) cannot be ruled out from the XRD data and further research is needed.

Figure 1

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Figure 2

Figure 2

V43

Präklinische in vitro Evaluierung von neuen Zirkon-basierten Nanokompositen und deren Oberflächenstrukturen für die Entwicklung von Implantaten

*B. Altmann1, T. Steinberg2, K. Rabel2, S. Proksch3, R.- J. Kohal1

1UNIVERSITÄTSKLINIKUM FREIBURG, Klinik für Zahnärztliche Prothetik, Freiburg im Breisgau, Deutschland

2 UNIVERSITÄTSKLINIKUM FREIBURG, Abteilung für Orale Biotechnologie, Freiburg im Breisgau, Deutschland

3UNIVERSITÄTSKLINIKUM FREIBURG, Klinik für Zahnerhaltung und Parodontologie, Freiburg im Breisgau, Deutschland

Einleitung:

Die physiko-chemischen und topographischen Eigenschaften einer Implantatoberfläche beeinflussen entscheidend die Zellantwort im Zielgewebe und spielen damit eine wichtige Rolle für eine effektive Knochen- und Weichgewebsintegration des Implantats. Aus diesem Grund ist die frühzeitige Identifizierung biokompatibler Materialzusammensetzungen und gewebekompatibler Oberflächenstrukturierungen bei der Entwicklung neuer medizinischer Implantate obligat. Daher wurde in der hier vorgestellten Arbeit die initiale Antwort gewebespezifischer Zielzellen, den primären humanen Osteoblasten aus dem Alveolarknochen (AO) und Fibroblasten aus der humanen Gingiva (GF), zur Vorauswahl aussichtsreicher Implantatoberflächen auf Zirkonbasis, mittels Genexpressionsanalyse untersucht.

Materialien und Methoden:

Hierzu wurden AO auf mikrorauen und GF auf glatten Zirkonproben unterschiedlicher chemischer Zusammensetzung und Topographie kultiviert, und die Modulation von 84 Genen nach 24h und 7 Tagen mittels der „Real-Time-PCR Array-Technologie“ evaluiert. Die Oberflächen für AO bestanden aus (i) einem neuentwickelten ceriumstabilisierten Nanokomposit mit zwei unterschiedlichen Topographien (Ce-TZP), (ii) einer Zirkondioxid-Schicht (ZrO2), und (iii) einem für Dentalimplantate üblichen yttriumstabilisierten Zirkon (Y-TZP) als Kontrolle. Für GF wurden Ce- und Y-TZP mit gleicher Topographie verwendet.

Ergebnisse und Diskussion:

Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass AO auf dem neuen Ce-TZP im Vergleich zur Kontrolle unabhängig von der Oberflächentopographie ein vergleichbares Genexpressionsmuster aufweisen. Im Gegensatz dazu konnte auf der ZrO2-Oberfläche eine signifikante Hochregulation von Biomarkern beobachtet werden, die mit der Aktivierung knochenresorbierender Zellen und dem Abbau der Extrazellularmatrix (EZM) assoziiert sind. Bei den GF-Oberflächen fiel lediglich auf, dass auf Ce- und Y-TZP nach 24h deutlich mehr Gene unterschiedlich exprimiert wurden als an Tag 7. Die Ergebnisse dieser initialen Studie zeigen, dass mit der vorgestellten Strategie weniger geeignete Oberflächen durch ein Screening-Verfahren im Vorfeld ausgeschlossen werden können, um so eine Vorauswahl an vielversprechenden Materialkonfigurationen für weiterführende präklinische in vitro Untersuchungen festgelegen zu können.

V44

A One-step Approach for Multimodal Functionalization of Electrospun Nanofibers and Their Application for Immune-regulatory Surfaces

*L. Wistlich1, J. Kums2, K.- H. Heffels1, H. Wajant2, J. Groll1

1Universität Würzburg, Abteilung für Funktionswerkstoffe der Medizin und der Zahnheilkunde, Würzburg, Deutschland

2Universitätsklinikum Würzburg, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Abteilung für Molekulare Innere Medizin, Würzburg, Deutschland

Introduction:

Electrospinning is a well-established cost efficient method to produce polymer meshes with high surface area composed of fibers with diameters from micro to nanometer scale.1 We have described before that a hexafunctional reactive macromolecular additive, six-armed star-shaped poly(ethylene oxide-stat-propylene oxide) prepolymers with isocyanate groups at the distal ends of polymer chains, can be used during electrospinning of biodegradable polyester solutions for selective enrichment at and bioactivation of the fiber surface.2 In this study we demonstrated that the isocyanate reactive groups can be exploited for multimodal fiber surface functionalization within one fiber preparation step.

Materials and Methods:

Poly(D,L-lactic-co-glycolide) and NCO-sP(EO-stat-PO) were solved in DMSO and acetone (1/9 v/v) and electrospun with 0.5 ml/h flow rate, 15 cm collection distance and 13 kV on a rotating drum. For functionalization, fibers were produced as shown in Figure 1a for the biotinstreptavidin method or with RGD for cell experiments by adding it to the spinning solution. Freshly spun meshes were subsequently incubated either with solutions of different fluorescent dyes or with solutions of biomolecules of interest to be immobilized.

Results and Discussion:

Besides the published reduced protein adsorption and controllable cell attachment2 we show a three-fold functionalization method illustrating the results with fluorescence staining accompanied with specific, controlled protein linkage via biotin-streptavidin system (Figure 1b). Furthermore, we use this approach to generate biochemical activity by dual immobilization with different TNFα-antibodies and detection over Gaussia Luciferase activity, and we demonstrate altered interleukin-8 production of HT1080 cells as response to the presented immobilized antibodies.

In summary, we establish a simple and robust strategy to independently tune cell adhesiveness and biochemical activity of electrospun meshes with only one fiber preparation step by using a reactive macromere additive. With the demonstrated effect on IL-8 production of adherent cells in vitro we envision that such meshes could be used as immunomodulatory wound dressing materials.

References:

(1) Greiner, A.; Wendorff, J. H. Angew Chem Int Ed Engl2007, 46, 5670.

(2) Grafahrend, D. et al. Nat Mater2011, 10, 67.

Figure 1

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Ü03

Novel bioceramics for intelligent neuroimplantation

*R. Gadow1, F. Kern1, A. Killinger1

1Universität Stuttgart, Instituts für Fertigungstechnologie keramischer Bauteile, Stuttgart, Deutschland

Deep Brain Stimulation (DBS) is a promising therapy that shows excellent results in the treatment of chronic diseases such as Parkinson’s disease, tremor, epilepsy and chronic pain with electric impulses in specific areas of the brain. Due to the fact that the probes are made of metal, their localization during the operation with the help of the Magnetic Resonance Imaging (MRI) is not possible because of physical interference. As a consequence, surgeons have to perform test stimulations of the brain in order to localize a specifically targeted section. For these test stimulations, the patient has to be awake and needs a stressful mechanical fixation.

A novel approach in achieving higher precision settings is the development of MRI compatible DBS probes. The challenge was to develop a MRI compatible, non-metallic probe material with high stiffness and strength characteristics but also sufficient toughness and flexibility. In this work, different compositions of nano-sized ceramic multiphase feedstocks with the aim of processing long and dimensional highly accurate MRI compatible substrates via extrusion technology were investigated as well as the further functionalization of the ceramic probe surface.

Different Physical Vapor Deposition (PVD) and Chemical Vapor Deposition (CVD) based thin solid films with sufficient electrical conductivity and minimal magnetic interference in the MRI were developed and evaluated. As a first step in the development of a multi-contact electrode, the laser-structuring of these thin film coatings was investigated. In conclusion, an important progress for a less stress and painful but more patient-friendly and performing DBS therapy has been developed with substantial contribution of ceramic materials research, component manufacturing and surface technology research.

Published Online: 2015-10-5
Published in Print: 2015-10-1

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