BY-NC-ND 3.0 license Open Access Published by De Gruyter November 28, 2017

Funktion von extrazellulären Vesikeln und Bedeutung für die labormedizinische Diagnostik

Functions of extracellular vesicles and their application as biomarkers
Katrin S. Reiners, Juliane Dassler-Plenker, Christoph Coch and Gunther Hartmann
From the journal LaboratoriumsMedizin

Zusammenfassung:

Gesunde und pathologisch veränderte Zellen des Körpers setzen extrazelluläre Vesikel (EV) frei, welche eine Vielzahl an Botenstoffen wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipiden beinhalten. Diese beeinflussen nicht nur das umgebende Gewebe, in dem sie freigesetzt werden, sondern haben auch systemische Funktionen. Zahlreiche Studien belegen, dass EV im gesunden wie im pathologischen Kontext als Mediatoren in der interzellulären Kommunikation von großer Bedeutung sind. Ihre Funktion ist durch ihre spezifische Zusammensetzung bestimmt, die nicht allein Zelltyp-, sondern auch Kontext-abhängig ist und von Zellstress und Mutationen beeinflusst wird. EV pathologisch veränderter Zellen unterscheiden sich damit von EV gesunder Zellen. Aufgrund dieser Eigenschaft sind extrazelluläre Vesikel prinzipiell auch als Biomarker in der klinischen Diagnostik interessant. In diesem Übersichtsartikel fassen wir das aktuelle Verständnis der physiologischen Funktion von EV zusammen und erörtern den möglichen Einsatz von EV als prognostische und diagnostische Biomarker.

Abstract:

Extracellular vesicles (EV) are released by healthy and diseased cells, including virus-infected and malignant cells. They carry a multitude of functional molecules such as proteins, nucleic acids and lipids. Numerous studies have revealed EV as important mediators of intercellular communication acting on neighboring cells as well as distant tissues. The content of EV is determined by the originating cell type and its functional state. Thus, phenotypic differences in EV content can be useful to identify pathological changes in the originating cell types. The analysis of changes in the molecular composition of EV provide the basis for the use of EV as biomarkers for clinical diagnostics. Here, we summarize the current knowledge regarding the physiological function of EV and discuss their potential for the development of prognostic and diagnostic biomarkers.

Einleitung

Die Kommunikation zwischen Zellen ist für alle multizellulären Organismen von wesentlicher Bedeutung. Der Informationsaustausch zwischen Zellen kann dabei durch direkten Zell-Zell-Kontakt oder mittels löslicher Faktoren erfolgen. Darüber hinaus setzen die meisten Zellen membran-umhüllte Vesikel frei, die sowohl benachbarte als auch Zellen in entfernten Geweben beeinflussen. Über die Existenz membran-umhüllter Vesikel wird seit Jahrzehnten berichtet [1], [2], [3]. Zunächst nahm man an, dass diese extrazellulären Vesikel (EV) durch Ausstülpungen der Plasmamembran gebildet werden. Anfang der 1980iger Jahre wurde erstmalig ein komplexerer EV Sekretionsweg beschrieben, demzufolge die Vesikel zunächst intra-luminal in multivesikulären Endosomen (MVE) gebildet werden [4], [5]. Erst die Fusion der MVE mit der Plasmamembran führt dann zur Freisetzung der Vesikel. Extrazelluläre Vesikel können aus verschiedensten Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin, Speichel, Muttermilch, Aszites, Fruchtwasser, Liquor, Sperma, Lymph- und Gallenflüssigkeit isoliert werden [6], [7], [8].

Lange Zeit wurde den extrazellulären Vesikeln wenig biologische Bedeutung beigemessen. Man vermutete, dass die Zellen die Vesikel lediglich nutzen, um sich überflüssiger Proteine und anderer Moleküle zu entledigen, also eine Art Abfallentsorgungsystem sind [9]. Erst Mitte der 1990iger Jahre wurden immunologische Funktionen der extrazellulären Vesikel nachgewiesen [10], [11], [12]. Mittlerweile ist in zahlreichen Studien die fundamentale Bedeutung von EV für den Erhalt normaler physiologischer Prozesse, wie z.B. Stammzell-Homöostase, Immunabwehr, Gewebereparatur oder Blutgerinnung, aber auch in der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen nachgewiesen [8], [13].

Klassifizierung, Biogenese, Aufbau und Signalwege

Extrazelluläre Vesikel lassen sich anhand der Biogenese in drei Gruppen klassifizieren: (1) die beim kontrollierten Zelltod durch Membran-Blebbing entstehenden Apoptosekörperchen bilden mit 500–2000 nm die Gruppe der größten Vesikel; (2) Mikrovesikel werden durch Ausstülpung und Abschnürung der Zellmembran gebildet und haben eine Größe von 50–1000 nm; (3) Exosomen weisen eine Größe von 40–120 nm auf und werden über den endolysosomalen Weg in multivesikulären Endosomen (MVE) generiert. MVE entstehen während der Reifung vom frühen zum späten Endosom, wenn durch Invagination sogenannte intra-luminale Vesikel (ILV) im Endosom akkumulieren [13]. Durch Fusion der MVE mit der Zellmembran, werden die ILV in den intrazellulären Raum als Exosomen freigesetzt [14] (Abbildung 1A).

Abbildung 1: Biogenese und Funktion von Extrazellulären Vesikeln.(A) Lebende Zellen setzen kontinuierlich Vesikel in den extrazellulären Raum frei. Dabei werden über den endosomalen Biogeneseweg Exosomen (i) aus dem Multivesikulären Endosom (MVE) freigesetzt oder durch Abschnürung der Plasmamembran Mikrovesikel (ii) gebildet. Während des kontrollierten Zelltods (Apoptose) bilden sich durch Membran-Blebbing Apoptosekörperchen (iii). Auch Prokaryoten geben sogenannte Outer-Membranvesikel (iv) ab, die insbesondere von Gram-negativen und in geringerem Maße auch von Gram-positiven Bakterien produziert werden. (B) Extrazelluläre Vesikel können als auf verschiedenen Wegen die Empfängerzelle beeinflussen. Zum einen transferieren sie funktionelle Moleküle wie Nukleinsäuren und Proteine, wenn sie durch Phagozytose (i) oder Zellmembranfusion (ii) aufgenommen werden bzw. mit der Empfängerzelle verschmelzen. Zum anderen können sie durch Bindung an Oberflächenrezeptoren (iii) eine direkte Aktivierung und Signaltransduktion induzieren oder antigenpräsentierende Funktion (iv) haben. F: Flagellum.

Abbildung 1:

Biogenese und Funktion von Extrazellulären Vesikeln.

(A) Lebende Zellen setzen kontinuierlich Vesikel in den extrazellulären Raum frei. Dabei werden über den endosomalen Biogeneseweg Exosomen (i) aus dem Multivesikulären Endosom (MVE) freigesetzt oder durch Abschnürung der Plasmamembran Mikrovesikel (ii) gebildet. Während des kontrollierten Zelltods (Apoptose) bilden sich durch Membran-Blebbing Apoptosekörperchen (iii). Auch Prokaryoten geben sogenannte Outer-Membranvesikel (iv) ab, die insbesondere von Gram-negativen und in geringerem Maße auch von Gram-positiven Bakterien produziert werden. (B) Extrazelluläre Vesikel können als auf verschiedenen Wegen die Empfängerzelle beeinflussen. Zum einen transferieren sie funktionelle Moleküle wie Nukleinsäuren und Proteine, wenn sie durch Phagozytose (i) oder Zellmembranfusion (ii) aufgenommen werden bzw. mit der Empfängerzelle verschmelzen. Zum anderen können sie durch Bindung an Oberflächenrezeptoren (iii) eine direkte Aktivierung und Signaltransduktion induzieren oder antigenpräsentierende Funktion (iv) haben. F: Flagellum.

Mittlerweile wird davon ausgegangen, dass insbesondere Exosomen nicht einen zufälligen Querschnitt der zytosolischen Bestandteile einer Zelle enthalten, sondern gezielt mit funktionellen Molekülen, einschließlich Proteinen, beladen werden. Die zugrundeliegenden Mechanismen, die zur selektiven Beladung der ILV während der Biogenese führen, sind nach wie vor noch nicht vollständig verstanden. Es wurden jedoch inzwischen verschiedene Wege der Beladung mit Proteinen aufgezeigt. Der wohl am besten untersuchte und verstandene Sortierweg, über den Proteine gezielt in ILV transportiert werden, ist die ESCRT-Maschinerie (endosomal sorting complex required for transport). Die ESCRT-Maschinerie setzt sich aus insgesamt vier Protein-Komplexen (ESCRT-0, -I, -II und -III) zusammen, die entsprechend ihrer kanonischen Reihenfolge nummeriert wurden. Jeder ESCRT-Komplex hat seine spezifische Aufgabe: ESCRT-0 bindet ubiquitinierte Proteine und bringt sie zum Endosom; ESCRT-I zusammen mit ESCRT-II initiieren die Invagination der endosomalen Membran; ESCRT-III ist in die de-Ubiquitinylierung der Proteine involviert sowie für die endgültige Vesikelabschnürung in das Lumen des MVE verantwortlich [15]. Ergänzt wird diese Maschinerie durch assoziierte Proteine wie ALIX und TSG101 [16]. Darüber hinaus sind ESCRT-unabhängige Aufnahmemechanismen von zytosolischen Proteinen beschrieben. Dazu gehören neben der unspezifischen Aufnahme von zytosolischen Proteinen die Lipid-Affinitäts-gesteuerte (GPI-anchored) und Ceramid-abhängige Aufnahme [17]. Auch Mikrodomänen mit hohem Tetraspanin-Anteil (tetraspanin-enriched microdomains, TEM) beeinflussen die EV-Zusammensetzung [18], [19]. Insgesamt sind die Prozesse der gezielten Beladung von EV jedoch noch weitgehend unverstanden.

Nach wie vor ist es methodisch nicht möglich, die Vesikel der unterschiedlichen Gruppen klar voneinander zu trennen. Einen wichtigen Beitrag hierzu leisten die Bemühungen der Internationalen Gesellschaft für extrazelluläre Vesikel (ISEV: www.isev.org). Eines ihrer Ziele ist, die Nomenklatur und Definition der verschiedenen EV-Subtypen, welche derzeit noch Gegenstand kontroverser Diskussionen sind, zu vereinheitlichen und eine Normierung der verwendeten Methoden im Vesikel-Feld zu erreichen [20]. Eine Gemeinsamkeit aller EV ist, dass sie durch eine Lipid-Doppelmembran begrenzt sind, auf der sie bioaktive Oberflächenmoleküle tragen. Aktuell werden EV mittels verschiedener Kriterien definiert. Dazu gehört neben der Größe auch die Aufreinigungsmethode, die klassisch über differentielle Zentrifugation resp. Dichtegradientenzentrifugation, durch Polymer-basierte Präzipitation, Größenausschlusschromatographie oder Ultrafiltration erfolgen kann. Ergänzt wird das Methodenspektrum durch die Immunpräzipitation mittels Antikörper-beladenen Beads, sofern bereits spezifische Marker der interessierenden Vesikelpopulation bekannt sind [21]. Typischerweise findet man in Exosomen eine Anreicherung der Proteine, die für ihre Biogenese benötigt werden. So sind Exosomen in der Regel positiv für ESCRT-zugehörige Proteine wie ALIX und TSG101, sowie die Tetraspanine CD9, CD81 oder CD63 [22]. Letztere werden in der Regel auch als Antigene für die Aufreinigung via Immunpräzipitation verwendet. Allerdings sind diese Proteine auch auf Mikrovesikeln und Apoptosekörperchen nachweisbar, so dass eine Unterscheidung von Exosomen und anderen EV alleine über die oben genannten Proteinmarker nicht möglich ist.

Für EV konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, dass sie als Transportvehikel zum Austausch funktionell aktiver Moleküle zwischen Zellen dienen [11], [23], [24], [25]. Dabei unterscheidet sich die Verteilung dieser Moleküle in den EV von Zelltyp zu Zelltyp und wird darüber hinaus durch Faktoren wie Aktivierungsstatus, Zellstress oder Mutationen beeinflusst. Die Datenbanken ExoCarta (http://exocarta.org) und Vesiclepedia (http://www.microvesicles.org) bemühen sich, die bislang beschriebenen Proteine, RNA und Lipide möglichst vollständig zu dokumentieren. Vesiclepedia weist beispielsweise zum Zeitpunkt der Manuskripterstellung 92.897 Protein-Einträge, 27.642 mRNA und 4934 miRNA-Einträge sowie knapp 600 Lipid-Einträge aus insgesamt 586 Studien auf und bildet damit eine hervorragende Datenquelle in der EV-Forschung. Diese Zahlen verdeutlichen bereits, dass mannigfache EV-Phänotypen mit individuellen Charakteristika existieren, deren Einfluss auf die Empfängerzelle sehr unterschiedlich ist. Dennoch lassen sich EV oft anhand ihres spezifischen Protein-Bestands ihrem sezernierenden Zelltyp zuordnen. So sind beispielsweise EV aus Antigen-präsentierenden Zellen mit Antigen-präsentierenden Molekülen, einschließlich der Haupthistokompatibilitätskomplexe MHC-I und II, sowie kostimulatorischen Molekülen angereichert. Tumorzellen sezernieren EV, die meist Tumorantigene tragen und häufig immunsuppressive Proteine wie FasL, TGFβ oder TRAIL beinhalten. Neben Proteinen und Lipiden lassen sich auch DNA und verschiedene RNAs, messenger RNA aber auch non-coding RNAs wie miRNAs und long non-coding RNAs (lncRNA) in EV nachweisen. Auf sehr elegante Weise haben Ridder et al. nachgewiesen, dass EV funktionelle mRNA aus Tumorzellen in Empfängerzellen transferieren. Sie zeigten im murinen System, dass Cre Rekombinase exprimierende Glioma- und Lungenkarzinom-Zelllinien funktionelle Cre-mRNA haltige EV freisetzten. Die Transplantation dieser Zelllinie in Cre-Reportermäuse verursachte insbesondere in CD45-positiven Leukozyten sowie in Myeloid-derived Suppressor Zellen Cre-induzierte Rekombinationen [24]. miRNAs scheinen eine Schlüsselfunktion insbesondere hinsichtlich Tumor-fördernder Eigenschaften zu haben [26]. Offensichtlich erfolgt auch bei den RNAs eine gezielte Sortierung, so dass die RNA-Menge in EV sich von der RNA-Menge in der EV-sezernierenden Zelle erheblich unterscheiden kann [23], [27]. Interessanter Weise lassen sich Tumor-EV dennoch anhand ihrer spezifischen Signatur von EV gesunder Eltern-Zellen unterscheiden. Auch hier sind die Prozesse, die für Selektion und Verpackung der RNA verantwortlich sind, nach wie vor noch weitestgehend unverstanden [14].

Die jeweilige Zusammensetzung aus Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren kann darüber entscheiden, an welchen Zelltyp die EV binden, oder ob sie aktivierende oder inhibitorische Eigenschaften haben. Prinzipiell können EV die Zielzellen über verschiedene Wege beeinflussen: Zum einen durch Bindung an Oberflächenrezeptoren auf der Zelle, wodurch es zu einer Aktivierung der Signaltransduktion kommt, zum anderen durch den Transfer von Proteinen und Nukleinsäuren in die Zelle. Dies erfolgt entweder durch Fusion mit der Plasmamembran, wodurch der EV-Lumeninhalt in das Zytoplasma der Zielzelle entlassen wird, oder durch Endozytose, bei der zunächst das intakte EV phagozytiert und anschließend, über noch nicht vollständig aufgeschlüsselte Wege, der EV-Inhalt ins Zytoplasma freigesetzt wird (Abbildung 1B).

Biologische Funktion

Es steht heute außer Frage, dass EV in zahlreichen physiologischen und pathologischen Funktionen involviert sind. Die Rolle von EV als Mediatoren in der Zell-Zell-Kommunikation hat man erst in den letzten 10 Jahren erkannt und untersucht. Zahlreiche Forschungsergebnisse zeigen, dass EV nicht nur physiologische Prozesse wie die Immunantwort [28] und die Laktation steuern, sondern auch zur Progression von Krankheiten wie beispielsweise neurodegenerativen Erkrankungen [29] und insbesondere Krebs beitragen. Empfängerzellen werden von EV in Abhängigkeit von ihrer spezifischen Fracht funktionell beeinflusst. So konnte gezeigt werden, dass mRNA-haltige EV unter Stressbedingungen zum Zellüberleben und zur Reparatur von Gewebeschäden beitragen [25], [30]. Auch der Einfluss von EV als parakriner Nachrichtenübermittler auf die Immunantwort ist inzwischen vielfach untersucht und wird kontrovers diskutiert. Der Effekt kann sowohl immunstimulatorisch sein, als auch – wie für Tumor-Vesikel sehr häufig beschrieben – eine adäquate Immunantwort inhibieren.

Immunaktivierung durch Extrazelluläre Vesikel

Die EV von Monozyten/Makrophagen beeinflussen das Immunsystem auf mehreren Ebenen. Beispielsweise kann die Differenzierung von naiven Monozyten zu Makrophagen durch Makrophagen-EV gesteuert werden. Dabei spielen vor allem in EV-transportierte miRNAs die entscheidende Rolle in der myeloiden Zellproliferation und -differenzierung.Zusätzlich exprimieren Makrophagen-EV MHC II und kostimulatorische Moleküle auf ihrer Oberfläche, was eine Funktion in der Antigenpräsentation nahelegt. Von besonderer Bedeutung sind Makrophagen-EV vor allem im Kontext mikrobieller Infektionen. Eine Infektion von Makrophagen mit Mikroorganismen verändert die Zusammensetzung der Makrophagen-EV und führt durch eine verstärkte EV-Sezernierung zu einer pro-inflammatorischen Immunreaktion gegen die Infektion in umgebenden, nicht infizierten Makrophagen. Dieser Zusammenhang konnte im Rahmen von mycobacterium tuberculosis Infektionen gezeigt werden und unterstreicht die immunstimulatorischen Eigenschaften der EV [31].

EV von Immunzellen können durch die Expression von Antigen-präsentierenden und kostimulatorischen Molekülen (z.B. MHC I und II, CD86) die Immunantwort beeinflussen. EV von B-Zellen tragen MHC I, MHC II, kostimulatorische Moleküle und Adhäsionsproteine, durch die sie eine Antigen-spezifische T-Zell-Antwort anstoßen können. Dendritische Zellen sezernieren kontinuierlich EVs, die vor allem in der Initiierung und der Verstärkung einer Immunantwort wichtig sind. So können DC-EV mittels Kreuzpräsentation Antigene von Pathogenen präsentieren und damit eine Immunantwort gegen das Pathogen induzieren. Darüber hinaus können DC-EV die Aktivierung und Proliferation von NK-Zellen stimulieren [11]. Da sich die Charakteristika von dendritischen Zellen in DC-EV widerspiegeln, testete man DC-EV als Option in der Krebstherapie bereits in klinischen Studien. Dafür wurden DC-EV mit tumor-assoziiertem Antigen beladen, mit dem Ziel, so eine tumor-spezifische Immunantwort auszulösen. In zwei klinischen Phase I Studien wurde die Beladung von DC-EV mit dem Tumor-Antigen MAGE (melanoma-associated antigen) in Melanom- und NSCLC (nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom) Patienten getestet. Beide Studien belegen eine systemische Immunaktivierung sowie eine gute Verträglichkeit der DC-EV [32], [33]. Dies zeigte auch eine klinische Phase II Studie, wobei hier eine NK Zell-Aktivierung nachgewiesen werden konnte, während keine Antigen-spezifische T Zellantwort zu verzeichnen war [34]. Darüber hinaus sind EV von Mastzellen durch den Transfer von immunmodulatorischen Proteinen (wie MHC II, ICAM-1, HSP) an Prozessen der DC-Reifung, der Kreuzpräsentation sowie an der Antigen-spezifischen T-Zell-Aktivierung beteiligt [35]. EV können daher als Antigen-Quelle betrachtet werden, die durch ihre spezifische Zusammensetzung im Kontext von Infektionen, Inflammation und Tumorerkrankungen ihre Umgebung repräsentieren. Die Aufnahme dieser EV in Antigen-präsentierende Zellen ermöglicht die Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort.

Neben dem Transfer von Antigen und Antigenantwort-initiierenden Molekülen sind es vor allem Liganden von Rezeptoren des angeborenen Immunsystems (immunsensorische Rezeptoren: immune sensing receptors) wie z.B. TLR-Liganden, mit denen EV die Aktivierung des Immunsystems beeinflussen können. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der zytoplasmatischen Helikase RIG-I (retinoic acid-inducible gene I) durch seinen Liganden 3pRNA in Tumorzellen in einer erhöhten Freisetzung von Tumor-EV resultiert, die eine verstärkte Expression des NK-Zell-aktivierenden NKp30-Liganden BAG6 aufweisen. Die durch 3pRNA induzierten BAG6-positiven Tumor-EV aktivieren NK-Zellen und erhöhen ihr zytotoxisches Potential gegenüber Tumorzellen in Abhängigkeit von NKp30 [36].

Wenig bekannt ist bisher über die Eigenschaften der EV von Virus-infizierten Zellen. Virusinfektionen verändern die Qualität und Quantität von EV. Am Beispiel einer Hepatitis C Virusinfektion in Hepatozyten konnte gezeigt werden, dass die von diesen Zellen gebildeten EV virale genomische und sub-genomische RNAs transportieren und in den Leber-infiltrierenden plasmazytoiden dendritischen Zellen zur Bildung des antiviralen Typ I Interferons führen. Damit tragen sie entscheidend zur antiviralen Immunantwort bei [31]. Einen ähnliche gesteigerte Immunantwort gegen ein Pathogen konnte für Retikulozyten-EV beobachtet werden, die mit Plasmodium yoelli infiziert sind [35].

Immunsuppression durch extrazelluläre Vesikel

Zahlreiche Publikationen dokumentieren immuninhibitorische Eigenschaften von EV. Interessanterweise sind EV ohne die Anwesenheit eines Pathogens immunsuppressiv. Unreife Dendritische Zellen (DC) setzen CD95L und IL-10-positive EV frei, die an der Entstehung von Toleranz beteiligt sind. EV aktivierter T-Zellen tragen MHC, TCR, APO2L, FasL und NKG2D Liganden auf ihrer Oberfläche und sind so in der Lage, NK-Zell-Zytotoxizität und T-Zell-Stimulierung zu blockieren. Gleichzeitig fördern sie T-Zell-Apoptose und vermindern die Fähigkeit Antigen-präsentierender Zellen, T-Zellen zu aktivieren. Inflammatorische Prozesse können durch EV aus Zellen des angeborenen Immunsystem negativ reguliert werden (z.B. durch TGFβ). Neutrophilen-EV führen bei DC und Monozyten zu einer verstärkten Sekretion von on TGFβ und zu einer verminderten Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine (IL8, IL6, TNFα) [8].

Häufig werden EV von infizierten oder malignen Zellen als immunsuppressiv beschrieben. So tragen EV von Leishmania-infizierten Makrophagen das Leishmania-Protein GP63, welches benachbarte Makrophagen inhibiert und so die Immunantwort behindert. Auch Viren nutzen die Kommunikation über extrazelluläre Vesikel zu ihren Gunsten. Am besten untersucht sind hier die von HIV und EBV induzierten EV. EV von EBV-infizierten B-Zellen übertragen beispielsweise LMP1 auf nicht infizierte Zellen in der Umgebung und tragen damit zu einer erhöhten Viruslatenz und zur Tumorprogression bei [8].

Tumorzellen sezernieren EV, die zum Immunescape, zur Ausbildung einer prä-metastatischen Nische oder zum Organotropismus bei Metastasenbildung beitragen [37], [38]. Die anti-Tumorantwort wird durch Tumor-EV auf verschiedene Weise behindert: Zum Teil durch direkte Induktion des Zelltods von Immunzellen über sogenannte „death ligands“ wie z.B. Fas Ligand oder TNFα (Tumor Nekrose Faktor α). Zum Teil wirken Tumor-EV auch indirekt immunsuppressiv, indem sie die Expansion regulatorischer T-Zellen oder myeloider Suppressorzellen induzieren. NK-Zellen werden u.a. durch NKG2D-Ligand- und TGFβ–positiven Tumor-EV in ihrer Zytotoxizität gehemmt, oder der aktivierende Rezeptor NKG2D auf NK-Zellen herabreguliert [39]. Zudem sind für Tumor-EV vielfache T-Zell-inhibierende Eigenschaften nachgewiesen worden: eine verstärkte Expression inhibitorischer Gene in CD4-positiven T-Zellen; die Expression von Ektonukleotidasen CD73 und CD39, die über erhöhte extrazelluläre Adenosinproduktion T-Zellen supprimieren; die Hemmung des T-Zell-Rezeptor Signalwegs durch Induktion von Sauerstoffradikalen (reactive oxigen species, ROS) [39], [40].

Nicht-Immun Effekte von extrazellulären Vesikeln

Extrazelluläre Vesikel beeinflussen nicht nur das Immunsystem, sondern auch das Gewebe und spielen insbesondere bei der Gestaltung des Tumormikromilieus eine wichtige Rolle. So konnte für Tumor-EV gezeigt werden, dass sie Einfluss auf die Angiogenese [41] oder die Zellproliferation [42], [43] haben können. Auch wurden Hinweise gefunden, dass EV zur Regulierung des Zellmetabolismus, zur Apoptosevermeidung und Metastasenbildung beitragen, indem sie beispielsweise ein verstärktes Migrations- und Invasionsverhalten der Tumorzellen induzieren [44].

Extrazelluläre Vesikel in der Diagnostik und als prognostische Marker

Das Interesse an EV ist vielfältig und richtet sich neben ihrer funktionellen Bedeutung im Körper auch auf praxisorientierte Fragestellungen, z.B. ihren potentiellen Nutzen als Biomarker bei verschiedensten Erkrankungen. Der ideale Biomarker sollte mit minimal-invasiven Methoden einfach zu analysieren sein und dabei gleichzeitig eine hohe Sensitivität und Spezifität aufweisen. Extrazelluläre Vesikel sind eine äußerst attraktive Quelle für neue Biomarker, da sie eine Reihe angereicherter Moleküle tragen. Diese können als diagnostische Marker fungieren, sofern die Veränderungen der Herkunftszelle sich in einem spezifischen Molekül auf dem EV widerspiegeln. Diese Marker bilden mit weniger als 0,01% im Gesamtproteom der Körperflüssigkeiten einen nur sehr kleinen Anteil. Erst die Anreicherung dieser diagnostischen Marker, die während der Biogenese selektiv in die EV transportiert werden, ermöglicht es, die meist recht schwach exprimierten Biomarker aufzufinden. Sie bleiben ansonsten mit Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze unbemerkt. Darüber hinaus gibt es für Erkrankungen wie z.B. dem Prostatakarzinom oder Hirntumoren bislang nur unzureichende diagnostische und prognostische Methoden [45]. Die standardmäßig durchgeführten Stanzbiopsien sind in ihrer Genauigkeit oft unzureichend. Zudem führt die invasive Diagnostik nicht selten zu unnötigen Komplikationen und trägt signifikant zur Morbidität bei [46]. Die Etablierung weiterer, minimal-invasiver Diagnosewege, wie die Bestimmung von zirkulierenden Tumorzellen, zellfreier DNA (cfDNA) oder extrazellulärer Vesikel ist deshalb essentiell. Die Identifizierung solch leicht zugänglicher Biomarker, die als „Liquid biopsy“ einfach aus Blut oder Urin gewonnen werden können, erlaubt zudem wiederholte Probenentnahmen und ermöglichen so Verlaufsuntersuchungen und Risikostratifizierung von Patienten. EV sind unter anderem attraktive Biomarker, da die in den Vesikeln befindlichen Nukleinsäuren und Proteine vor der enzymatischen Degradierung durch im Serum vorhandene Nukleasen und Proteasen geschützt sind. Dies erleichtert die Analyseprotokolle erheblich, denn dadurch besteht ein vergleichsweise weites Zeitfenster zur Probenverarbeitung und unverfälschten Datengenerierung. Außerdem wird geprüft, ob EV als Biomarker für Therapieansprechen oder zur Früherkennung einer Therapieresistenz dienen können. So konnten Kharaziha und Kollegen zeigen, dass Exosomen dazu dienen könnten, eine erworbene Resistenz gegen Docetaxel anzuzeigen [47].

In weiteren Studien wurde untersucht, ob EV bei bakteriellen und viralen Erkrankungen geeignete Biomarker darstellen [31], [48]. Dabei gibt es Hinweise, dass auch die EV-Konzentration in den verschiedenen Körperflüssigkeiten Auskunft über den Erkrankungsgrad geben kann. Selektiver, und damit auch sensitiver, sind Analysen, die EV phänotypisch untersuchen und charakterisieren.

Das Proteinprofil der EV als Biomarker

Die Analyse von Oberflächenproteinen auf extrazellulären Vesikeln kann mittels ELISA oder durchflusszytometrisch erfolgen, während die Massenspektrometrie Aufschluss über das Proteinprofil der Vesikel gibt. Mit Hilfe dieser Methoden wurden in den letzten Jahren eine Reihe von exosomalen Brustkrebsmarkern wie EpCAM, CD24 oder Survivin identifiziert. Letzteres befindet findet sich ebenfalls in erhöhtem Maß auf EVs von Patienten mit Prostatakarzinom. Aus dem Plasma von Patientinnen mit Gebärmutterhalskrebs lassen sich Exosomen isolieren, die TGFβ1 und MAGE3/6 tragen, während dieser Vesikelphänotyp bei Patientinnen mit gutartigen Tumoren nicht nachweisbar ist [49]. Bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen konnte exosomales PSMA7 (proteasome subunit alpha type 7) als vielversprechender Biomarker identifiziert werden, was womöglich eine Alternative zur bislang durchgeführten Koloskopie eröffnet [50].

Die Herausforderung bei diesen Analysen ist es, spezifische EV-Subpopulationen anzureichern, Albumin und andere Serumproteine aus der Probe zu eliminieren, ohne dabei EV zu verlieren. Es gibt einige Veröffentlichungen, die über die erfolgreiche Entwicklung schneller Hochdurchsatz-Plattformen berichten. Mit Assays wie „ExoChip“ (Quantifizierung via CD63-Bindung, miRNA-Profiling), „ExoScreen“ (Bindung und Erkennung CD9, CD147 doppeltpositiver EV) oder „ExoSearch“ (quantitative EV-Isolierung und Nachweis der exosomalen Gebärmutterhalskrebs-Marker CA-125, EpCam und CD24) sind inzwischen verschiedene Tests entwickelt [49]. Das Analyseverfahren ExoTEST (HansaBioMed, Estland), das Exosomen in Plasma und anderen Körperflüssigkeiten quantifizieren kann, ist noch in der Entwicklungsphase. In allen Assays basiert die zugrundeliegende Isolierungs- und Detektionsmethode auf Immunaffinität mit Antikörpern gegen EV-Marker und/oder Tumorantigene. Aufgrund der hohen Heterogenität der EV bergen diese Assays grundsätzlich die Gefahr, dass das vorhandene EV-Profil nicht vollständig erfasst wird.

Nukleinsäuren der EV als Biomarker

Nukleisäureanalysen aus EV haben ergeben, dass neben miRNA und mRNA, die zusammen den größten Anteil ausmachen, transfer RNA (tRNA), long noncoding RNA (lncRNA) und auch einzel- wie doppelsträngige DNA transportiert werden. Die im EV-Lumen befindlichen Nukleinsäuren sind dort weitestgehend vor einem möglichen enzymatischen Abbau geschützt. Ihre Zusammensetzung hängt stark vom Zustand der Zelle ab. Dies macht sie als potentielle Biomarker für die klinische Diagnostik interessant.

DNA

In einem low-coverage whole-genome sequencing Ansatz konnte gezeigt werden, dass sich in den EV doppelsträngige DNA (dsDNA) aus dem gesamten Chromsomensatz wiederfindet. dsDNA in EV reflektiert somit die genomische DNA (gDNA) der Herkunftszelle und kann damit potentiell Veränderungen wie Kopienzahlvariation (CNV) oder Mutationen abbilden [51]. So wurden beispielsweise bei mehr als 90% aller Bauchspeicheldrüsenkrebs-Patienten die nachweisbaren KRAS und P53 Mutationen auch in EV von Pankreaszelllinien identifiziert [52]. Gleiches gilt für BRAF und EGFR Mutationen in dsDNA aus EV von Melanom und Lungenkrebszelllinien [51]. Im Falle von lokalisiertem Pankreaskarzinom wurden mit Hilfe der KRAS-Mutationsanalyse der EV-DNA mehr Patienten identifiziert, als das mittels cfDNA-Analyse der Fall war [53]. cfDNA wird ausschließlich durch apoptotische und nekroptotische Zellen freigesetzt und ist somit im Plasma erst nachweisbar, wenn Tumorzellen sterben. Im Gegensatz dazu werden EV konstitutiv von lebenden Tumorzellen abgegeben. Dies ermöglicht ein weitgehend behandlungs-unabhängiges Verlaufsmonitoring. Nach dem derzeitigen Kenntnisstand erscheint die Kombination aus cfDNA- und EV-Analyse ein vielversprechender Ansatz zur Etablierung einer präzisen und verlässlichen, auf „Liquid Profiling“-basierenden Diagnostik.

Protein-kodierende RNA (mRNA)

Neben dem Vorkommen von DNA berichten einige Publikationen über den Nachweis und die Identifizierung von mRNA in extrazellulären Vesikeln. So konnten in extrazellulären Vesikeln von Glioblastomzellen mittels Microarray-Analyse 27.000 verschiedene Transkripte identifiziert werden. Die Analysen ergaben zudem, dass einige dieser mRNAs im Verhältnis zu ihrer Häufigkeit in der Zelle vorzugsweise in EV verpackt wurden (2238 mRNAs) oder in besonders geringer Zahl (1188 mRNAs) zu finden waren [42]. Skog und Kollegen waren zudem in der Lage, bei 7 von 25 Glioblastompatienten die tumorspezifische mRNA Variante des EGF-Rezeptors (EGFRvIII) in Serum-EV zu detektieren [42]. In einem Modelsystem führte die Stimulierung von ZNS-patroullierenden Makrophagen mit beta-Amyloid Peptid (Aβ1-42) zur Sekretion von Zytokin-mRNA-haltigen EV, die für die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung von Bedeutung sind. Die Autoren postulieren, dass die Zytokin-mRNAs in EV womöglich zu einer Aβ-induzierten, diffusen Neuroinflammation beitragen [54]. Darüber hinaus belegt der EV-Transfer der mRNA für das Reporterprotein Gaussia Luciferase zu Zielzellen, dass in EV befindliche mRNAs prinzipiell funktional sind und in der Empfängerzelle translatiert werden können [42], [55].

microRNA

Von allen Nukleinsäuren in EV haben miRNA bislang die größte Aufmerksamkeit erfahren. Die Menge und Auswahl sekretierter miRNA (se-miRNA) hängt von Erkrankungsgrad und ihrer Regulierung durch den malignen Phänotyp ab. Ein wesentlicher Vorteil von miRNA gegenüber mRNA und lncRNA ist die relativ geringe Anzahl von möglichen Sequenzen (<2000), was die Analyse erheblich vereinfacht. Bis heute wurden zahlreiche miRNA (z.B. miR-21, miR-141, miR-200a/b/c, miR-203, miR-205 und miR-214 in Tumor-EV bei Gebärmutterhalskrebs) in EV identifiziert, die bereits als diagnostische Marker aus Tumorbiopsien bekannt waren. Darüber hinaus identifizierten RNA sequencing-basierte miRNA Profiling-Analysen in verschiedenen Tumormodellen wie Brustkrebs, Kolon-, Prostata- und Pankreaskarzinom sowie beim Glioblastom eine Reihe von EV-miRNA, die potentiell als prognostische oder diagnostische Marker in Frage kommen. Einige davon, wie miR-21 und miR-1246, finden sich in Tumor-EV verschiedener Entitäten [49]. Auch bei kardiovaskulären Erkrankungen kann eine veränderte miRNA-Expression für die Diagnosestellung und Krankheitskontrolle nützlich sein [56]. Die Sensitivität und Spezifität von miRNA als Biomarker könnte durch ergänzende Plasmaanalysen zirkulierender miRNA-Argonaut2 Komplexe womöglich noch erhöht werden [57].

Arron Thind und Clive Wilson beurteilen die Eignung von miRNA aus EVs für die Anwendung in der klinischen Diagnostik zum derzeitigen Forschungsstand jedoch noch als kritisch. Sie kommen zu dem Schluss, dass zunächst erhebliche Fortschritte bei Isolierung und Detektion von EV-RNA sowie ein wesentlich besseres Verständnis ihrer Biogenese und Funktion in der Tumorzell-Kommunikation notwendig sind [26]. Diese Meinung wird auch in dem kürzlich veröffentlichten ISEV-Positionsartikel vertreten, der einen umfassenden Überblick über die Hindernisse und Chancen der funktionellen Analyse von EV-RNA gibt [58].

Vozel und Kollegen haben 65 klinischen Studien aus den Jahren 2010 bis 2015, die sich mit extrazellulären Vesikeln als potentielle Biomarker befassen, analysiert. Es zeigt sich, dass die Vergleichbarkeit aufgrund stark divergierender Probenverarbeitung problematisch ist [59]. Die wesentlichen Faktoren, die einen quantitativen und qualitativen Effekt auf EV im Plasma haben sind (1) Transport, (2) Zeitdauer bis zur Probenverarbeitung und (3) Aufreinigungsbedingungen (u.a. Zentrifugationsbedingungen und Filtrationsgrößen) [60]. Dies verdeutlicht die Notwendigkeit, einfache und standardisierte Analyseverfahren zu entwickeln, die idealerweise ohne langwierige Isolierungsschritte auskommen, damit EV als verlässliche Biomarker in der klinischen Diagnostik Anwendung finden können. Erste Produkte sind bereits auf dem Markt. So hat die Firma Exosome Diagnostics (exosomedx) derzeit verschiedene Tests für Prostata- und Lungenkrebs entwickelt. Bei diesen sogenannten „True Liquid Biopsy“ Tests wird exosomale RNA auf bekannte, häufig in diesen Entitäten vorkommende Mutationen untersucht. Darüber hinaus hat Exosome Diagnostics seit Anfang 2017 das erste vollautomatisierte Gerät zur Erfassung und Bestimmung von Exosomen aus Plasma in klinischer Testung. Laut Herstellerangaben ist das Gerät in der Lage, innerhalb weniger Minuten quantitativ und spezifisch krankheitsassoziierte Proteine und mRNA zu bestimmen. Es wird sich zeigen, ob es den Ansprüchen einer sensitiven, akkuraten und robusten Diagnostik in der klinischen Validierung standhalten kann.

Fazit

Extrazelluläre Vesikel sind wichtige Informationsmittel zwischen Zellen, die durch den Transport verschiedenster Proteine, bioaktiver Lipide und genetischer Informationen den Phänotyp und die Funktion der Empfängerzellen beeinflussen können. Somit wird EV heute in zahlreichen biologischen und pathologischen Prozessen eine wichtige Bedeutung beigemessen. Da die Zusammensetzung von EV nicht allein Zelltyp-, sondern auch Kontext-abhängig ist und von Stress und Mutationen beeinflusst wird, eignen sich EV prinzipiell auch für die Diagnostik. So lassen sich anhand der EV-Zusammensetzung beispielsweise Tumor-EV von EV gesunder Zellen unterscheiden. Damit jedoch EV in Zukunft eine entscheidende Rolle in der Diagnostik spielen können, bedarf es noch der Optimierung und Validierung bestehender Isolierungs- und Charakterisierungsmethoden. Dank der rasanten Entwicklung in diesem Feld, gerade auch in Hinblick auf Charakterisierungsmöglichkeiten und Qualitätskontrollen, steht die diagnostische Nutzung von EV in naher Zukunft außer Frage (Abbildung 2).

Abbildung 2: Arbeitsschritte zur Detektion und Analyse von Extrazellulären Vesikel aus Körperflüssigkeiten.

Abbildung 2:

Arbeitsschritte zur Detektion und Analyse von Extrazellulären Vesikel aus Körperflüssigkeiten.


Korrespondenz: Prof. Dr. med.Gunther Hartmann, Institut für Klinische Chemie und Klinische Pharmakologie, Universitätsklinikum Bonn, Sigmund-Freud-Str. 25, 53127 Bonn, Deutschland

  1. Autorenbeteiligung: Alle Autoren tragen Verantwortung für den gesamten Inhalt dieses Artikels und haben der Einreichung des Manuskripts zugestimmt.

  2. Forschungsförderung: Deutsches Zentrum für Infektionsforschung (DZIF), DFG EXC1023 ImmunoSensation und DFG SFB670 an GH.

  3. Interessenkonflikt: Die Autoren erklären, dass keine wirtschaftlichen oder persönlichen Interessenkonflikte bestehen.

Literatur

1. Anderson HC. Vesicles associated with calcification in the matrix of epiphyseal cartilage. J Cell Biol 1969;41:59–72.577579410.1083/jcb.41.1.59 Search in Google Scholar

2. Crawford N. The presence of contractile proteins in platelet microparticles isolated from human and animal platelet-free plasma. Br J Haematol 1971;21:53–69.425431210.1111/j.1365-2141.1971.tb03416.x Search in Google Scholar

3. Stegmayr B, Ronquist G. Promotive effect on human sperm progressive motility by prostasomes. Urol Res 1982;10:253–7.6219486 Search in Google Scholar

4. Harding C, Heuser J, Stahl P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. J Cell Biol 1983;97:329–39.630985710.1083/jcb.97.2.329 Search in Google Scholar

5. Pan BT, Johnstone RM. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: selective externalization of the receptor. Cell 1983;33:967–78.630752910.1016/0092-8674(83)90040-5 Search in Google Scholar

6. Keller S, Ridinger J, Rupp A-K, Janssen JW, Altevogt P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J Transl Med 2011;9:86.10.1186/1479-5876-9-8621651777 Search in Google Scholar

7. Gallo A, Tandon M, Alevizos I, Illei GG. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes. PLoS One 2012;7:e30679.2242780010.1371/journal.pone.0030679 Search in Google Scholar

8. Yáñez-Mó M, Siljander PR, Andreu Z, Zavec AB, Borràs FE, Buzás EI, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles 2015;4:27066.2597935410.3402/jev.v4.27066 Search in Google Scholar

9. Johnstone RM, Mathew A, Mason AB, Teng K. Exosome formation during maturation of mammalian and avian reticulocytes: evidence that exosome release is a major route for externalization of obsolete membrane proteins. J Cell Physiol 1991;147:27–36.203762210.1002/jcp.1041470105 Search in Google Scholar

10. Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R, Harding CV, Melief CJ, et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J Exp Med 1996;183:1161–72.10.1084/jem.183.3.11618642258 Search in Google Scholar

11. Théry C, Ostrowski M, Segura E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol 2009;9:581–93.1949838110.1038/nri2567 Search in Google Scholar

12. Bobrie A, Colombo M, Raposo G, Théry C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic 2011;12:1659–68.2164519110.1111/j.1600-0854.2011.01225.x Search in Google Scholar

13. EL Andaloussi S, Mäger I, Breakefield XO, Wood MJ. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov 2013;12:347–57.10.1038/nrd397823584393 Search in Google Scholar

14. Rashed MH, Bayraktar E, Helal GK, Abd-Ellah MF, Amero P, Chavez-Reyes A, et al. Exosomes: from garbage bins to promising therapeutic targets. Int J Mol Sci 2017;18:538.10.3390/ijms18030538 Search in Google Scholar

15. Raiborg C, Stenmark H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature 2009;458:445–52.1932562410.1038/nature07961 Search in Google Scholar

16. Colombo M, Moita C, Van Niel G, Kowal J, Vigneron J, Benaroch P, et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. J Cell Sci 2013;126:5553–65.10.1242/jcs.12886824105262 Search in Google Scholar

17. Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, Rajendran L, Wenzel D, Wieland F, et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes. Science 2008;319:1244–7.1830908310.1126/science.1153124 Search in Google Scholar

18. Reiners KS, Daßler J, Coch C, Pogge von Strandmann E. Role of exosomes released by dendritic cells and/or by tumor targets: regulation of NK Cell Plasticity. Front Immunol 2014;5:91.24639679 Search in Google Scholar

19. Perez-Hernandez D, Gutiérrez-Vázquez C, Jorge I, López-Martín S, Ursa A, Sánchez-Madrid F, et al. The intracellular interactome of tetraspanin-enriched microdomains reveals their function as sorting machineries toward exosomes. J Biol Chem 2013;288:11649–61.10.1074/jbc.M112.44530423463506 Search in Google Scholar

20. Gould SJ, Raposo G. As we wait: coping with an imperfect nomenclature for extracellular vesicles. J Extracell Vesicles 2013;2:20389.10.3402/jev.v2i0.20389 Search in Google Scholar

21. Coumans FA, Brisson AR, Buzás EI, Dignat-George F, Drees EE, El-Andaloussi S, et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circ Res 2017;120:1632–48.2849599410.1161/CIRCRESAHA.117.309417 Search in Google Scholar

22. Lötvall J, Hill AF, Hochberg F, Buzás EI, Di Vizio D, Gardiner C, et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles 2014;3:26913.10.3402/jev.v3.2691325536934 Search in Google Scholar

23. Valadi H, Ekström K, Bossios A, Sjöstrand M, Lee JJ, Lötvall JO. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 2007;9:654–9.10.1038/ncb159617486113 Search in Google Scholar

24. Ridder K, Sevko A, Heide J, Dams M, Rupp A-K, Macas J, et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of functional RNA in the tumor microenvironment. Oncoimmunology 2015;4:e1008371.2615541810.1080/2162402X.2015.1008371 Search in Google Scholar

25. Eldh M, Ekström K, Valadi H, Sjöstrand M, Olsson B, Jernås M, et al. Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA. PLoS One 2010;5:e15353.2117942210.1371/journal.pone.0015353 Search in Google Scholar

26. Thind A, Wilson C. Exosomal miRNAs as cancer biomarkers and therapeutic targets. J Extracell Vesicles 2016;5:31292.2744010510.3402/jev.v5.31292 Search in Google Scholar

27. Villarroya-Beltri C, Gutiérrez-Vázquez C, Sánchez-Cabo F, Perez-Hernandez D, Vázquez J, Martin-Cofreces N, et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nat Comms 2013;4:328. Search in Google Scholar

28. Simhadri VR, Reiners KS, Hansen HP, Topolar D, Simhadri VL, Nohroudi K, et al. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS One 2008;3:e3377.1885287910.1371/journal.pone.0003377 Search in Google Scholar

29. Zappulli V, Friis KP, Fitzpatrick Z, Maguire CA, Breakefield XO. Extracellular vesicles and intercellular communication within the nervous system. J Clin Investig 2016;126:1198–207.10.1172/JCI81134 Search in Google Scholar

30. Bruno S, Grange C, Collino F, Deregibus MC, Cantaluppi V, Biancone L, et al. Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury. PLoS One 2012;7:e33115.10.1371/journal.pone.0033115 Search in Google Scholar

31. Fleming A, Sampey G, Chung M-C, Bailey C, van Hoek ML, Kashanchi F, et al. The carrying pigeons of the cell: exosomes and their role in infectious diseases caused by human pathogens. Pathog Dis 2014;71:109–20.2444952710.1111/2049-632X.12135 Search in Google Scholar

32. Escudier B, Dorval T, Chaput N, André F, Caby M-P, Novault S, et al. Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic cell (DC) derived-exosomes: results of thefirst phase I clinical trial. J Transl Med 2005;3:10.1574063310.1186/1479-5876-3-10 Search in Google Scholar

33. Morse MA, Garst J, Osada T, Khan S, Hobeika A, Clay TM, et al. A phase I study of dexosome immunotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Transl Med 2005;3:9.10.1186/1479-5876-3-915723705 Search in Google Scholar

34. Besse B, Charrier M, Lapierre V, Dansin E, Lantz O, Planchard D, et al. Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC. Oncoimmunology 2016;5:e1071008.2714137310.1080/2162402X.2015.1071008 Search in Google Scholar

35. Gutiérrez-Vázquez C, Villarroya-Beltri C, Mittelbrunn M, Sánchez-Madrid F. Transfer of extracellular vesicles during immune cell-cell interactions. Immunol Rev 2013;251:125–42.10.1111/imr.1201323278745 Search in Google Scholar

36. Daßler-Plenker J, Reiners KS, van den Boorn JG, Hansen HP, Putschli B, Barnert S, et al. RIG-I activation induces the release of extracellular vesicles with antitumor activity. Oncoimmunology 2016;5:e1219827.10.1080/2162402X.2016.121982727853642 Search in Google Scholar

37. Hoshino A, Costa-Silva B, Shen T-L, Rodrigues G, Hashimoto A, Tesic Mark M, et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature 2015;527:329–35.10.1038/nature1575626524530 Search in Google Scholar

38. Costa-Silva B, Aiello NM, Ocean AJ, Singh S, Zhang H, Thakur BK, et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol 2015;17:816–26.10.1038/ncb316925985394 Search in Google Scholar

39. Kam W, Clauser E, Kim YS, Kan YW, Rutter WJ. Cloning, sequencing, and chromosomal localization of human term placental alkaline phosphatase cDNA. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82:8715–9.10.1073/pnas.82.24.8715 Search in Google Scholar

40. Clayton A, Al-Taei S, Webber J, Mason MD, Tabi Z. Cancer exosomes express CD39 and CD73, which suppress T cells through adenosine production. J Immunol 2011;187:676–83.10.4049/jimmunol.100388421677139 Search in Google Scholar

41. Feng Q, Zhang C, Lum D, Druso JE, Blank B, Wilson KF, et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nat Commun 2017;8:14450.10.1038/ncomms1445028205552 Search in Google Scholar

42. Skog J, Würdinger T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Curry WT, et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol 2008;10:1470–6.1901162210.1038/ncb1800 Search in Google Scholar

43. Hosseini-Beheshti E, Choi W, Weiswald L-B, Kharmate G, Ghaffari M, Roshan-Moniri M, et al. Exosomes confer pro-survival signals to alter the phenotype of prostate cells in their surrounding environment. Oncotarget 2016;7:14639–58.26840259 Search in Google Scholar

44. Rahman MA, Barger JF, Lovat F, Gao M, Otterson GA, Nana-Sinkam P. Lung cancer exosomes as drivers of epithelial mesenchymal transition. Oncotarget 2016;7:54852–66.27363026 Search in Google Scholar

45. Kebir S, Fimmers R, Galldiks N, Schäfer N, Mack F, Schaub C, et al. Late pseudoprogression in glioblastoma: diagnostic value of dynamic O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine PET. Clin Cancer Res 2016;22:2190–6.2667379810.1158/1078-0432.CCR-15-1334 Search in Google Scholar

46. Wiener RS, Schwartz LM, Woloshin S, Welch HG. Population-based risk for complications after transthoracic needle lung biopsy of a pulmonary nodule: an analysis of discharge records. Ann Intern Med 2011;155:137–44.10.7326/0003-4819-155-3-201108020-0000321810706 Search in Google Scholar

47. Kharaziha P, Chioureas D, Rutishauser D, Baltatzis G, Lennartsson L, Fonseca P, et al. Molecular profiling of prostate cancer derived exosomes may reveal a predictive signature for response to docetaxel. Oncotarget 2015;6:21740–54.2584459910.18632/oncotarget.3226 Search in Google Scholar

48. Simpson RJ, Lim JW, Moritz RL, Mathivanan S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics 2009;6:267–83.10.1586/epr.09.1719489699 Search in Google Scholar

49. Soung Y, Ford S, Zhang V, Chung J. Exosomes in cancer diagnostics. Cancers 2017;9:8–11.10.3390/cancers9010008 Search in Google Scholar

50. Zheng X, Chen F, Zhang Q, Liu Y, You P, Sun S, et al. Salivary exosomal PSMA7: a promising biomarker of inflammatory bowel disease. Protein Cell 2017;32:623–10. Search in Google Scholar

51. Thakur BK, Zhang H, Becker A, Matei I, Huang Y, Costa-Silva B, et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Res 2014;24:766–9.10.1038/cr.2014.4424710597 Search in Google Scholar

52. Kahlert C, Melo SA, Protopopov A, Tang J, Seth S, Koch M, et al. Identification of double-stranded genomic DNA spanning all chromosomes with mutated KRAS and p53 DNA in the serum exosomes of patients with pancreatic cancer. J Biol Chem 2014;289:3869–75.2439867710.1074/jbc.C113.532267 Search in Google Scholar

53. Allenson K, Castillo J, San Lucas FA, Scelo G, Kim DU, Bernard V, et al. High prevalence of mutant KRAS in circulating exosome-derived DNA from early-stage pancreatic cancer patients. Ann Oncol 2017;28:741–7.28104621 Search in Google Scholar

54. Mitsuhashi M, Taub DD, Kapogiannis D, Eitan E, Zukley L, Mattson MP, et al. Aging enhances release of exosomal cytokine mRNAs by A 1-42-stimulated macrophages. FASEB J 2013;27:5141–50.10.1096/fj.13-238980 Search in Google Scholar

55. Tannous BA, Kim D-E, Fernandez JL, Weissleder R, Breakefield XO. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Mol Ther 2005;11:435–43.10.1016/j.ymthe.2004.10.01615727940 Search in Google Scholar

56. Jansen F, Nickenig G, Werner N. Extracellular vesicles in cardiovascular disease. Circ Res 2017;120:1649–57.2849599510.1161/CIRCRESAHA.117.310752 Search in Google Scholar

57. Arroyo JD, Chevillet JR, Kroh EM, Ruf IK, Pritchard CC, Gibson DF, et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:5003–8.10.1073/pnas.1019055108 Search in Google Scholar

58. Mateescu B, Kowal EJ, van Balkom BW, Bartel S, Bhattacharyya SN, Buzás EI, et al. Obstacles and opportunities in the functional analysis of extracellular vesicle RNA – an ISEV position paper. J Extracell Vesicles 2017;6:1286095.10.1080/20013078.2017.128609528326170 Search in Google Scholar

59. Vozel D, Uršič B, Krek JL, Štukelj R, Kralj-Iglič V. Applicability of extracellular vesicles in clinical studies. Eur J Clin Invest 2017;47:305–13.2815600610.1111/eci.12733 Search in Google Scholar

60. Lacroix R, Judicone C, Poncelet P, Robert S, Arnaud L, Sampol J, et al. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles: towards standardization of protocol. J Thromb Haemost 2012;10:437–46.10.1111/j.1538-7836.2011.04610.x22212198 Search in Google Scholar

Received: 2017-6-20
Accepted: 2017-10-30
Published Online: 2017-11-28
Published in Print: 2017-12-20

©2017 Walter de Gruyter GmbH, Berlin/Boston

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