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  • Author: W. O. Gross x
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In dem Moment, in dem eine mit 15% Dimethylsulfoxid versetzte Zellsuspension beim langsamen Abkühlen einfriert, befindet sich sowohl das Gefriergut als auch der umgebende Alkohol weit unterhalb des Schmelzpunktes der Suspension. Ihr Schmelzpunkt beträgt —6,5 °C; die Mehrzahl der Ampullen gefriert aber erst zwischen —11 °C und —17 °C ein. Die Kältekapazität von Ampulleninhalt und umgebendem Alkohol ist groß genug, um zu verhindern, daß die beim Einfrieren aus der latenten Schmelzwärme freiwerdenden Kalorien das Gefriergut wieder über die Temperatur seines Schmelzpunktes erwärmen. Die Dimethylsulfoxid-haltige Zellsuspension erstarrt deshalb schlagartig und ohne Flüssigkeitsreste. Wenn kein Dimethylsulfoxid zugesetzt ist und deshalb die Einfriertemperatur ( — 3 °C) nahe beim Schmelzpunkt ( —2 °C) liegt, heizen die Kalorien der Schmelzwärme die Zellsuspension längere Zeit bis über ihren Schmelzpunkt auf. Diese Ampulle friert langsam ein mit allen Nachteilen des ausfrierenden Wassers und der dabei entstehenden osmotischen Unordnung.

Den Prozeß der schlagartigen, „trockenen“ Einfrierung kann man fördern, wenn man für den Moment der Einfrierung einen maximalen Temperaturausgleich im Gefriergut erzeugt. Dies ist nur bei langsamstem Abkühlen möglich. Eine 1 °C/Min.-Regel ist aber für jede Temperaturspanne, die mehr als 1— 2 °C über dem Einfrierpunkt liegt, unnötig. Der maximale Temperaturausgleich ist auch erreicht, wenn man auf der Temperatur vor dem Einfrieren verharrt, gleichgültig, wie schnell diese eingestellt worden ist.

Die mit dem Dimethylsulfoxid infiltrierten Zellen haben mit der umgebenden Flüssigkeit den gleich tief herabgesetzten Einfrierpunkt. Nach der Geschwindigkeit der Welle zu urteilen, die über das so vorbereitete Gefriergut läuft, sind die ersten und die letzten Teile der Zelle innerhalb 14000 Sek. erstarrt. Eine ähnlich schnelle und gleichmäßige Verwandlung der gefrorenen Zellen zurück in den flüssigen Zustand vollzieht sich beim üblichen Eintauchen in das 37 °C-Wasserbad. Sie ist aber schon bei — 6 °C vollzogen.

Da Dimethylsulfoxid nur beim Einfrieren und Auftauen zu schützen braucht, kann auf jeden Kontakt der Zellen mit diesem Mittel über —2 °C während der ganzen Gefrierkonservierung verzichtet werden. Das Verfahren, bei dem erst unterhalb dieses Temperaturpunktes das Dimethylsulfoxid mit den Zellen vermischt und auch, bevor noch eine Temperatur darüber beim Auftauen entsteht, schon wieder entfernt wird, hebt die giftige Wirkung des Dimethylsulfoxids auf die Zelle auf. Mit der relativ hohen Konzentration von 15% kann dann die volle Schutzwirkung des Mittels ausgenutzt werden. Die Überlebensraten von 12 solchermaßen gefrierkonservierten Zellstämmen ließen keine Wünsche mehr offen.

Die Temperaturverläufe während dieser Gefrier- und Auftauprozedur stimmen mit denen überein, die man für die Konservierung von Gewebe und Organen verlangen muß: Sie sind geeignet, den Stoffwechsel und eine schädliche Sauerstoffkonsumption gering zu halten. Das beschriebene Konservierungsverfahren gibt somit von vornherein die Gewähr für eine erfolgreiche Anwendung zur Gefrierkonservierung von Zellen und Geweben, die gegenüber Sauerstoffmangel empfindlich sind.

Wenn man aus Anti-Amnion (FL) -Seren alle gegen HeLa-Zellen wirksamen Agglutinine mit HeLa-Zellen absorbiert, bleibt noch ein Antikörper-Rest, der Amnionzellen agglutiniert. Mit diesem Agglutinin-Rest lassen sich HeLa-Zellstämme von Amnion (FL)-Zellstämmen unterscheiden.

Das Gewebe von immunisierten Ratten enthält in der Regel nach 72-stdg. Kultivierung und nachdem die Lymphoidzellen ausgewandert sind, weniger Agglutinine als es beim Ansetzen enthalten hat. Kontrollversuche in Flaschen mit und auch ohne Zellwachstum zeigen, daß die Brucella-Agglutinine die Bebrütungszeit von 72 Stdn. um das 5-fache ohne Titerverlust überstehen. Der Rückgang des Antikörpergehaltes während der Kultivierung der Gewebestückchen ist auch mit der Erhöhung des Serumgehaltes auf 50% im Kulturmedium und Zusatz von Gammaglobulin nicht zu verhindern.

Medien, die frei von Agglutininen sind, können, nachdem antikörperhaltiges Gewebe darin kultiviert worden ist, Agglutinine enthalten. Die hier auftretenden Agglutininmengen entsprechen in einigen Versuchen ungefähr den Mengen, die das Gewebestückchen beim Kultivieren verliert. Gewebe von immunisierten Ratten, das in die Gewebekultur explantiert worden war, bevor es im Körper antikörperhaltig wurde, blieb ebenso wie sein Nährmedium in der Gewebekultur immer agglutininfrei. Während der Kultivierung werden im Gewebe offenbar keine Brucella-Bakterien-Antikörper neu gebildet.

Daß die aus dem Körperverband herausgenommenen Antikörper-Produktionsstätten ihre Funktion bei den hochgradig physiologischen Ernährungsbedingungen des Rollröhrchens aufgeben, legt die Vermutung nahe, daß die Antikörper-Produktionsstätten in ihrer Funktion auf die Hilfe bestimmter aus dem Kreislauf kommender Zellen angewiesen sind. Die Lymphozyten und Plasmazellen, die in der Gewebekultur innerhalb von 72 Stdn. auswandern und ihre Antikörper in das Kulturmedium abgeben, kehren nicht mehr in die Keimzentren zurück, wie es im Organismus der Fall ist. Ohne die hier normalerweise stattfindende Cytolyse mangelt es wahrscheinlich an den verwandten Aufbaustoffen und der Energiequelle für die Lymphozyten- und Plasmazell-Neubildung sowie womöglich auch an einem Initiator für die Antikörpersynthese in diesen Zellen. Für die normale Funktion dieser Antikörper-Bildungsstätten ist offenbar der intakte Lymphoid-Zellkreislauf eine Vorbedingung.