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LaboratoriumsMedizin - Journal of Laboratory Medicine

Offizielles Organ der Deutschen Vereinten Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL) und affiliiert mit der Österreichischen Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie (ÖGLMKC)

Editor-in-Chief: Schuff-Werner, Peter

Editorial Board Member: Ahmad-Nejad, Parviz / Bidlingmaier, Martin / Borucki, Katrin / Karsten, Conrad / Fraunberger, Peter / Ghebremedhin, Beniam / Holdenrieder, Stefan / Kiehntopf, Michael / Klein, Hanns-Georg / Klouche, Mariam / Kohse, Klaus P. / Kratzsch, Jürgen / Luppa, Peter B. / März, Winfried / Nebe, Carl Thomas / Orth, Matthias / Ruf, Andreas / Sack, Ulrich / Steimer, Werner / Weber, Bernard / Wieland, Eberhard / Tumani, Hayrettin / Zettl, Uwe K.

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1439-0477
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Empfehlungen zur qualitätsgesicherten Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikations - Testungen (NAT) von Blutprodukten. Quality assurance in nucleic acid amplification testing (NAT) of blood products

Willi K. Roth
  • Institute of Transfusion Medicine and Immunohematology, German Red Cross, Johann Wolfgang Goethe University, Frankfurt, Deutschland
Published Online: 2005-07-05 | DOI: https://doi.org/10.1515/JLM.2005.016

Abstract

European manufacturers of plasma products and German blood transfusion services were the first to introduce nucleic acid amplification testing (NAT) of blood products in the mid-1990s. Their primary goal was to increase the safety of blood by closing as far as possible the diagnostic window, which exists after the onset of viral infection until the appearance of the first detectable antibodies. Sample preparation, transport and storage are crucial steps in a quality-controlled PCR. Sensitivity and contamination rates highly depend on the sample preparation and storage techniques. Anticoagulants must be selected carefully because some may inhibit the PCR. Dilution of samples by pooling needs to be considered and should be compensated for by subsequent virus enrichment procedures, e.g. centrifugation. The whole process of sample preparation, pooling and virus enrichment must be validated and quality control measures must be implemented. Reagents for the extraction of viral nucleic acids should not pose any risk to the laboratory staff. Nevertheless, the reagents should be highly efficient in liberating viral nucleic acids at high yield and purity for the following amplification reactions. At this critical stage, quality control measures should guarantee an efficient extraction process and contain potential sources of contaminations. Several methods are available for the amplification of nucleic acids. PCR is the most common, especially in in-house assays. The amplification of nucleic acids should be performed as far as possible in a closed system, which may be guaranteed best by real-time PCR approaches. Reaction tubes need never be opened during the amplification because detection can be performed through the closed tube. Amplicons that could contaminate the following PCR reactions will not be released. It is of great importance to blood transfusion services to guarantee that negative results un-equivocally indicate virus negative blood donations. Therefore, internal control sequences should be implemented in each individual PCR reaction in order to monitor that the individual PCR has worked correctly. Besides internal control sequences, external negative and positive controls should be implemented in each PCR run to demonstrate false positive reactions as well as to monitor pre-PCR processes like virus enrichment and extraction. The whole process needs to be validated according to the criteria set in national guidelines or by national authorities. External quality assessment programs are highly recommended.

Zusammenfassung

Die Nukleinsäure-Amplifikations Testung (NAT) von Blutprodukten wurde Mitte der 90er Jahre von europäischen Plasma verarbeitenden Firmen und großen deutschen Blutspendediensten entwickelt. Primäres Ziel war eine verbesserte Sicherheit von Blutprodukten, indem das so genannte diagnostische Fenster nach einer Virusinfektion bis zum ersten Nachweis von Antikörpern so weit wie möglich geschlossen werden sollte. Bei einer qualitätsgerechten PCR kommen bereits der Probenentnahme, dem Probentransport sowie der Probenlagerung große Bedeutung zu, da vermieden werden muß, daß es durch ungeeignete Antikoagulanzien oder Entnahmetechniken zu einem Sensitivitätsverlust kommt oder daß Kontaminationen falsch positive Ergebnisse hervorrufen. Wird ein Pooling von Proben durchgeführt, ergibt sich ein Verdünnungsfaktor, weshalb darauf zu achten ist, dass gegebenenfalls nachfolgende Anreicherungsschritte für Viren, wie z.B. eine Zentrifugation, implementiert werden. Der Gesamtprozeß von Pooling und Virusanreicherung ist ebenso wie die Probenvorbereitung durch geeignete Maßnahmen zu validieren und durch Qualitätssicherungsmaßnahmen zu flankieren. Die in der Extraktion der viralen Nukleinsäuren verwendeten Reagenzien sollten im Laboralltag möglichst einfach zu handhaben sein, keine Gefährdung des Laborpersonals darstellen und die Virus-Nukleinsäure gleichzeitig mit höchster Effizienz freisetzen und in sehr hoher Reinheit für die anschließende Amplifikation bereitstellen. Qualitätssicherungmaßnahmen sollen hier sowohl die geforderte Effizienz des Prozesses sichern als auch verhindern, daß es in dieser kritischen Phase zu Kontaminationen kommt. Zur Amplifikation stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, wobei die PCR, insbesondere bei inhouse-Systemen, die weiteste Verbreitung gefunden hat. Der Prozeß der Amplifikation sollte möglichst im geschlossenen System erfolgen, wie dies z.B. in Real-time PCR-Systemen die Regel ist, ohne daß das Reaktionsgefäß während oder nach dem Amplifikationsprozeß geöffnet werden muß. Dies gewährleistet eine hohe Sicherheit vor Kontaminationen durch freigesetzte Amplifikate. Im Blutspendewesen ist es von höchster Bedeutung, daß negative Ergebnisse tatsächlich negative Blutspenden anzeigen. Interne Kontrollen, die eine korrekte Funktionsweise jeder individuellen PCR signalisieren, sollten deshalb in jeder Reaktion mitgeführt werden. Neben internen Kontrollen sind externe Negativ- und Positiv-Kontrollen mitzuführen, um falsch positive Reaktionen nachzuweisen bzw. auch die vor der PCR liegenden Prozesse wie Virusanreicherung und Extraktion zu überwachen. Alle Prozesse sind nach den von den Behörden festgelegten Kriterien durchgängig zu validieren, und es ist routinemäßig an externen Qualitätskontrollmaßnahmen (Ringversuchen) teilzunehmen.

Schlüsselwörter/Keywords: Blutpräparate; Nukleinsäure-Amplifikations Testung (NAT); Qualitätssicherung; Validierung; blood components; nucleic acid amplification testing (NAT); quality assurance; validation


Published Online: 2005-07-05

Published in Print: 2005-04-01


Citation Information: LaboratoriumsMedizin. Volume 29, Issue 2, Pages 96–103, ISSN (Online) 0025-8466, ISSN (Print) 0342-3026, DOI: https://doi.org/10.1515/JLM.2005.016, July 2005

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