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Journal of Laboratory Medicine

Official Journal of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine

Editor-in-Chief: Schuff-Werner, Peter

Ed. by Ahmad-Nejad, Parviz / Bidlingmaier, Martin / Bietenbeck, Andreas / Conrad, Karsten / Findeisen, Peter / Fraunberger, Peter / Ghebremedhin, Beniam / Holdenrieder, Stefan / Kiehntopf, Michael / Klein, Hanns-Georg / Kohse, Klaus P. / Kratzsch, Jürgen / Luppa, Peter B. / Meyer, Alexander von / Nebe, Carl Thomas / Orth, Matthias / Röhrig-Herzog, Gabriele / Sack, Ulrich / Steimer, Werner / Weber, Thomas / Wieland, Eberhard / Winter, Christof / Zettl, Uwe K.


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Volume 38, Issue 1

Issues

Routine-taugliche durchflusszytometrische Methode zur Identifikation von Multiple Sklerose PatientInnen mit einer nicht ausreichenden Therapieeffizienz unter einer Natalizumab-Therapie

A routine-qualified flow cytometric method for the identification of multiple sclerosis patients with reduced therapy efficiency under natalizumab

Katrin Oppermann
  • Corresponding author
  • Universitätsklinik für Neurologie, Paracelsus Medizinische Privatuniversität, Christian-Doppler-Klinik/SALK, Salzburg, Österreich
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/ Andrea Harrer
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/ Georg Pilz
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/ Peter Wipfler
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/ Shahrzad Afazel
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/ Elisabeth Haschke-Becher
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/ Johann Sellner
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/ Florian Deisenhammer / Eugen Trinka
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/ Jörg Kraus
  • Universitätsklinik für Neurologie, Paracelsus Medizinische Privatuniversität, Christian-Doppler-Klinik/SALK, Salzburg, Österreich
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Published Online: 2014-02-06 | DOI: https://doi.org/10.1515/labmed-2013-0026

Zusammenfassung

Einleitung: Neutralisierende Antikörper gegen Natalizumab (NAB) kommen in 9% der mit Natalizumab behandelten Multiple Sklerose (MS) PatientInnen vor. Dies ist assoziiert mit einer verminderten Wirksamkeit von Natalizumab und in der Folge muss bei PatientInnen mit persistierenden NAB die Behandlung mit Natalizumab beendet werden.

Ziel: Da hohe Titer an NAB stark mit persistierenden NAB assoziiert sind, haben wir untersucht, ob die durchflusszytometrische Bestimmung der Sättigung des Alpha-4-Integrins mit Natalizumab das Potenzial hat, PatientInnen mit NAB früher zu identifizieren.

Methoden: Zellgebundenes Natalizumab und Natalizumab-Sättigung des Alpha-4 Integrins auf T-Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines monoklonalen anti-human IgG4 Antikörpers nachgewiesen. Mononukleäre Zellen wurden aus venösem Blut angereichert und bei PatientInnen mit NAB (n=4) 9 Monate lang alle 4 Wochen unmittelbar vor der nächsten Infusion und bei PatientInnen ohne NAB vor Beginn der Therapie und nach 1 (n=15), 2 (n=14), 3 (n=9), 6 (n=7) und 9 Monate (n=3) auf gebundenes Natalizumab untersucht. Der Natalizumab-Sättigungsgrad (in%) der T-Zellen wurde durch das ins Verhältnis Setzen von der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von in vivo gebundenem Natalizumab mit der MFI von mit in vitro mit Natalizumab gesättigten Immunzellen bestimmt. Die Bestimmung der NAB aus dem Serum wurde mittels ELISA durchgeführt.

Ergebnisse: Bei PatientInnen ohne NAB betrug die mittlere Natalizumab-Sättigung von T-Zellen über einen Zeitraum von 9 Monaten durchschnittlich 75% (95%iges Konfidenzintervall: 72–78%). Bei 2 der 4 PatientInnen mit NAB erreichte die Natalizumab-Sättigung der T-Zellen nach der ersten Infusion ca. 50% und fiel auf die Höhe des Ausgangsniveaus (Natalizumab-Sättigung vor Beginn der Therapie) nach der zweiten Infusion zurück. Im ELISA wurden niedrige NAB-Titer nach der ersten Infusion gemessen und die anschließende Entwicklung von anhaltend hoch titrigen NAB führte nach ca. 6 Monaten zum Abbruch der Therapie mit Natalizumab. Bei den zwei anderen PatientInnen betrug der Natalizumab-Sättigungsgrad der T-Zellen 74% und 68% nach der ersten Infusion, und ging danach vorübergehend auf das Ausgangsniveau zurück. Bei beiden PatintInnen erholten sich die Natalizumab-Sättigungen nach ca. 6 Monaten wieder. NAB wurden nach 2 bzw. 3 Monaten nachgewiesen und waren nach ca. 5 bis 6 Monaten wieder verschwunden.

Schlussfolgerungen: Die Überwachung der Natalizumab-Sättigung auf T-Zellen ist eine schnelle und zuverlässige Methode, um PatientInnen zu identifizieren, bei denen aufgrund von NAB Natalizumab nur vermindert wirken kann. Beides, hoch- und niedrig titrige NAB, reduzieren gleichermaßen effektiv die zelluläre Natalizumab-Sättigung. Interessanterweise zeigte die mittels Durchflusszytometrie gemessene Natalizumab-Sättigung, dass dieses Verfahren sehr empfindlich ist, da die NAB anscheinend länger wirksam sind, als die Nachweisgrenze des ELISA vermuten lässt.

Abstract

Background: Natalizumab-neutralizing antibodies (NABs) occur in 9% of natalizumab-treated multiple sclerosis (MS) patients. Loss of clinical and biological efficacy in patients with persisting NABs requires termination of natalizumab treatment. Because high-titer NABs are strongly associated with persistence of NABs, we investigated if determination of natalizumab saturation levels of α-4 integrins by flow cytometry has the potential to identify patients early with NABs.

Methods: Cell-bound natalizumab and natalizumab saturation of α-4 integrins on T cells were detected by flow cytometry using a monoclonal anti-human IgG4 antibody. Peripheral blood mononuclear cells were enriched from venous blood collected at the start (baseline) and every 4 weeks immediately before subsequent infusions until up to 9 months from natalizumab-treated patients with NABs (n=4) and at the start and after 1 (n=15), 2 (n=14), 3 (n=9), 6 (n=7), and 9 months (n=3) from natalizumab-treated patients without NABs. Natalizumab saturation (in %) of T cells was determined by relating median fluorescence intensities (MFIs) of in vivo bound natalizumab to MFIs after in vitro incubation with saturating amounts of natalizumab. Determination of serum NABs was performed by ELISA.

Results: In patients without NABs, the median natalizumab saturation of T cells over 9 months was 75% (confidence interval of 95%: 72–78%). In two of the four patients with NABs, natalizumab saturation of T cells only reached approximately 50% after the first infusion and further declined to baseline levels with the second infusion. Low-titer NABs were measured after the first infusion and development of persistent high-titer NABs led to termination of natalizumab treatment after 6 months. In another two patients, natalizumab saturation of T cells was 74% and 68% after the first infusion, temporarily decreased to approximately baseline levels and re-increased after approximately 6 months. Transient NABs were detected after 2 and 3 months, which resolved after 5 and 6 months.

Conclusions: Monitoring natalizumab saturation on T cells is a fast and reliable method to identify patients with a reduced treatment effect due to NABs. Both high- and low-titer NABs were equally effective in reducing cellular natalizumab saturation. We were able to show that natalizumab saturation, as detected by flow cytometry, is a sensitive method for detecting a prolonged NAB-mediated reduced treatment effect because NABs are apparently effective longer than suggested by the detection limit of ELISA.

Reviewed publication

KrausJ.

Keywords: Biomarker; Durchflusszytometrie; Multiple Sklerose; Natalizumab; neutralisierende Antikörper; biomarker; flow cytometry; multiple sclerosis; natalizumab; neutralizing antibodies

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About the article

Korrespondenz: Katrin Oppermann, Universitätsklinik für Neurologie, Paracelsus Medizinische Privatuniversität, Christian-Doppler-Klinik/SALK, Ignaz-Harrer-Str. 79, 5020 Salzburg, Austria, Tel.: +43-662-4483-56088, Fax: +43-662-4483-3004, E-Mail:


Received: 2013-10-24

Accepted: 2013-11-19

Published Online: 2014-02-06

Published in Print: 2014-02-01


Citation Information: LaboratoriumsMedizin, Volume 38, Issue 1, Pages 17–23, ISSN (Online) 1439-0477, ISSN (Print) 0342-3026, DOI: https://doi.org/10.1515/labmed-2013-0026.

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